[發明專利]一種裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法

有效

• 申請號: 201511002956.6
• 申請日: 2015-12-28
• 公開（公告）號: CN105738624B
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 李深偉;田楨干;楊志俊;周嫻;張子龍;李平
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/533
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 宋纓;孫健

1.一種非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：包括以下檢測步驟：

(1)表達裂谷熱病毒糖蛋白的293F細胞載玻片的制備:

將Expi293F細胞經貼壁培養至細胞狀態良好時，經胰酶消化后細胞計數，將細胞密度調整至4X10⁵個/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入細胞懸液，輕柔搖晃，置于細胞培養箱中培養24小時；此時細胞基本鋪滿孔底，再用裂谷熱病毒糖蛋白的全長基因表達質粒進行細胞轉染；用脂質體2000轉染質粒，以1ug質粒/2ul脂質體2000轉染試劑的比例進行；細胞轉染48小時后，得到表達的裂谷熱病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛進行細胞固定，固定完成再進行5％山羊血清封閉，封閉后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存；所用的裂谷熱病毒為病毒株200803170；

(2)樣品稀釋液和洗液的配置；

(3)表達裂谷熱病毒糖蛋白的293F細胞載玻片的平衡：將表達有裂谷熱病毒糖蛋白的293F細胞載玻片Chamber Slide從2-8℃取至室溫中，放置10分鐘；

(4)加入待測樣品、陽性對照、陰性對照；所述陽性對照為抗裂谷熱病毒糖蛋白GP的兔陽性血清，其制備包括如下步驟：將表達裂谷熱病毒毒株200803170糖蛋白GP的全長基因經分子克隆的方法克隆到IneratorTM載體后，用基因免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經首次免疫、二次免疫后，耳靜脈采血收集少量抗血清，經間接ELISA的方法檢測抗血清的效價，效價檢測>1:64000后進行加強免疫，二次免疫間隔3周后，10天之后收集抗血清；所述的陰性對照為未免疫新西蘭大白兔,制備過程同陽性對照；

(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復一次；

(6)加入熒光標記二抗；

(7)吸掉樣品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復一遍；

(8)結果判定：將載玻片Chamber Slide置于熒光顯微鏡下觀察熒光,判定結果，有綠色熒光的為陽性反應，無綠色熒光則未有免疫反應，表示樣本中不含有裂谷熱病毒抗體。

2.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(2)所述的稀釋液成分為5％山羊血清溶于0.01M的磷酸鹽緩沖液PBS中，所述的洗液成分為0.05％吐溫20溶于0.01M磷酸鹽緩沖液中。

3.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(4)所述陽性對照用稀釋液1：100稀釋，陰性對照用稀釋液1：100稀釋。

4.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(4)所述的待測樣品、陽性對照、陰性對照，每孔加入200ul，蓋上ChamberSlide蓋子，室溫放置60分鐘。

5.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(6)中所述的熒光標記二抗為羊抗兔與羊抗人二抗混合液。

6.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(6)中所述的熒光二抗混合液加入前用樣品稀釋液1:2000倍稀釋。

7.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：步驟(6)中所述的熒光二抗每孔加入200ul，室溫避光放置1小時，此步驟之后做避光處理。

8.根據權利要求1所述的非診斷目的的裂谷熱病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于：與在載玻片外進行與步驟(1)同步的裂谷熱病毒糖蛋白GP制備與純化驗證實驗，包括如下過程：

將Expi293F^TM細胞在Expi293F^TM表達培養基中進行懸浮培養，待細胞濃度增長到合適濃度時進行細胞轉染實驗；細胞使用ExpiFectamine^TM293轉染試劑進行細胞轉染；以30ml的培養體系進行轉染時，取兩個1.5ml的離心管A/B，A管中加入RPMI1640細胞培養液、200803170毒株GP DNA 30ug，總體積1.5ml，輕柔混勻；B管中加入RPMI1640細胞培養液、ExpiFectamine^TM轉染試劑80ul，總體積1.5ml，輕柔混勻，室溫孵育5分鐘后，把A加入B中，輕柔混勻，室溫孵育20分鐘加入細胞中；在轉染后96小時左右后收集蛋白；在蛋白制備過程中無需改變培養基或添加培養基，收集的細胞上清經Ni柱純化，得到表達的裂谷熱病毒糖蛋白GP。