[發明專利]一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510989510.0
• 申請日: 2015-12-24
• 公開（公告）號: CN105486856A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 陳海生;陳峰;孫宏偉;邵飛飛;劉振國
• 申請（專利權）人: 泰州澤成生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

技術領域

本發明涉及丙型肝炎抗體的檢測領域，具體為一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑 盒及其制備方法和應用，尤其是一種基于磁微粒分離化學發光法定性檢測人丙型肝炎抗體 (anti-HCV)的試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術

丙型肝炎病毒(HCV)是誘發丙型肝炎的罪魁禍首，其通過血液傳播。HCV感染常導 致慢性肝炎和肝硬化，并可能進展為肝細胞肝癌。臨床常伴有冷球蛋白血癥和各種風濕性 疾病的癥狀表現。

丙型肝炎病毒(HCV)是黃病毒科的一種單鏈正股RNA病毒，有衣殼。病毒基因組長 約9.5kb，編碼包括結構區和非結構區在內的3000個氨基酸多肽。如同其他RNA病毒，HCV在 復制過程中發生變異而形成多種變異株。全世界至少報道了11個不同的基因型和多種亞型 以及病毒變異體。不同基因型的病毒可能影響疾病的嚴重程度和治療效果。丙型肝炎病毒 主要通過被污染的血液和血制品傳播，通過人體液傳播的概率較小。

HCV抗體(Anti-HCV)檢測可單獨使用，也可以同其他檢測(如HCV-RNA)聯合使用， 檢測個體是否感染丙型肝炎病毒和篩選被HCV污染的血液和血制品。

在國內，丙型肝炎抗體檢測臨床上主要以間接捕獲法檢測丙型肝炎抗體應用為 主，且大部分是板式酶聯免疫法，靈敏度低，特異性價差，給患者帶來很大的精神及經濟負 擔。具有自主知識產權的直接標記雙抗原夾心磁微粒酶促化學發光方法的試劑盒目前應用 還較少，商品化的試劑盒主要停留在間接捕獲法檢測丙型抗體或者板式的水平上。間接捕 獲法由于人血清中含有大量的人IgG干擾，很容易出現假陽性，靈敏度較低、特異性較差；板 式檢測方式，操作復雜，靈敏度低，同時也不利于高通量的全自動檢測。

因此，有待開發直接標記的雙抗原丙型肝炎抗體(anti-HCV)檢測靈敏度高與特異 性強，并能降低檢測成本的檢測技術。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的丙型肝炎抗體檢測的靈敏度低，特異性價 差、成本昂貴的缺陷，提供一種靈敏度高、特異性強、成本低的直接標記雙抗原丙型肝炎抗 體(anti-HCV)檢測法。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，包括定標液、陰性對照品、陽性對照品、抗 試劑、磁微粒試劑和發光底物；

其中所述定標液、陰性對照品、陽性對照品采用含蛋白的緩沖液溶解人血清純化 的丙型肝炎抗體，并用含新生牛血清的緩沖液按一定比例稀釋得到；

所述抗試劑是將異硫氰酸熒光素標記的重組的丙型肝炎抗原和堿性磷酸酶標記 的重組的丙型肝炎抗原，按比例加入到Tris鹽緩沖液中制得；

所述磁微粒試劑是將抗異硫氰酸熒光素抗體與磁微粒偶聯制得，通過抗異硫氰酸 熒光素抗體與異硫氰酸熒光素的特異性結合使抗原抗體免疫復合物固定在磁微粒上；

所述的發光底物為ALPS。

進一步的，所述的抗試劑的制作方法為：

1)、用緩沖液配置濃度為1.0～5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液；

2)、將重組的丙型肝炎抗原和異硫氰酸熒光素溶液轉移到棕色玻璃瓶中，室溫下 攪拌1～2小時；

3)、使用pH8～9的碳酸氫鹽緩沖液進行平衡、洗脫純化，得到異硫氰酸熒光素標 記的重組的丙型肝炎抗原；

4)、用緩沖液配置濃度為1.0～5.0mg/mL的堿性磷酸酶溶液；

5)、將堿性磷酸酶溶液和重組的丙型肝炎抗原按照摩爾比為1:2～1:10的比例轉 移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌4-5小時；

6)、使用pH8～9的碳酸氫鹽緩沖液進行平衡、洗脫純化，堿性磷酸酶標記的重組 的丙型肝炎抗原；