[發明專利]一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510989510.0
• 申請日: 2015-12-24
• 公開（公告）號: CN105486856A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 陳海生;陳峰;孫宏偉;邵飛飛;劉振國
• 申請（專利權）人: 泰州澤成生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，包括定標液、陰性對照品、陽性 對照品、抗試劑、磁微粒試劑和發光底物；

其中所述定標液、陰性對照品、陽性對照品采用含蛋白的緩沖液溶解人血清純化的丙 型肝炎抗體，并用含新生牛血清的緩沖液按一定比例稀釋得到；

所述抗試劑是將異硫氰酸熒光素標記的重組的丙型肝炎抗原和堿性磷酸酶標記的重 組的丙型肝炎抗原，按比例加入到Tris鹽緩沖液中制得；

所述磁微粒試劑是將抗異硫氰酸熒光素抗體與磁微粒偶聯制得，通過抗異硫氰酸熒光 素抗體與異硫氰酸熒光素的特異性結合使抗原抗體免疫復合物固定在磁微粒上；

所述的發光底物為ALPS。

2.如權利要求1所述的一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，所述的抗試 劑的制作方法為：

1)、用緩沖液配置濃度為1.0～5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液；

2)、將重組的丙型肝炎抗原和異硫氰酸熒光素溶液轉移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌1 ～2小時；

3)、使用pH8～9的碳酸氫鹽緩沖液進行平衡、洗脫純化，得到異硫氰酸熒光素標記的 重組的丙型肝炎抗原；

4)、用緩沖液配置濃度為1.0～5.0mg/mL的堿性磷酸酶溶液；

5)、將堿性磷酸酶溶液和重組的丙型肝炎抗原按照摩爾比為1:2～1:10的比例轉移到 棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌4-5小時；

6)、使用pH8～9的碳酸氫鹽緩沖液進行平衡、洗脫純化，堿性磷酸酶標記的重組的丙 型肝炎抗原；

7)、將步驟3)得到的異硫氰酸熒光素標記的重組的丙型肝炎抗原和步驟6)得到的堿性 磷酸酶標記的重組的丙型肝炎抗原加入到含表面活性劑的Tris鹽緩沖液中制得抗試劑。

3.如權利要求1所述的一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，所述的磁微 粒試劑的制作方法為：

1)、取充分混勻后的羧基磁珠濃縮液加入至反應瓶中，將反應瓶置于磁場中15min，待 羧基磁珠全部沉降后吸去上清；

2)、向反應瓶中加入2～5倍于羧基磁珠體積的磷酸緩沖液，混勻20～30min；

3)再次將反應瓶置于磁場中15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清；

4)、重復步驟2)和3)一次，然后用緩沖液將羧基磁珠定容到10～50mg/mL；

5)、向羧基磁珠溶液中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，混勻狀態、2～8℃下反應18小時； 其中羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體的質量比為100:1；

6)、使用磷酸緩沖液清洗3遍，定容至10mg/mL；2～8℃保存待用。

4.如權利要求1所述的一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，所述發光底 物ALPS的制備方法為：

1)、配置發光底物緩沖液；所述發光底物緩沖液中各成分的質量分數為：三乙醇胺2％， 二乙醇胺0.75％，CTAB2％，N，N-二甲二叮呢硝酸鹽0.3％，牛血清白蛋白0.15％， Bronidox0.5％，用鹽酸將發光底物緩沖液的pH調為9.5；

2)、用4～10倍于ALPS體積的發光底物緩沖液充分溶解ALPS。

5.如權利要求2所述的一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，所述的步驟 7)中的表面活性劑為Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一種或多種，質量濃度為 0.01％～0.5％。

6.如權利要求1所述的一種定性檢測丙型肝炎抗體的試劑盒，其特征在于，所述的含新 生牛血清的緩沖液中添加有質量分數為0.01％～0.05％的防腐劑四環素、0.1％～0.5％的 硫酸新霉素、0.1％～0.5％的proclin300，添加防腐劑后的新生牛血清的緩沖液用0.22μm 的濾膜過濾。