[發(fā)明專利]檢測多菌靈的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510973048.5
• 申請日: 2015-12-23
• 公開（公告）號: CN105403703B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范子彥;陳黎;魯亞輝;羅曉琴;潘立寧;胡斌;唐綱嶺;劉惠民;趙正苗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院;國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心;北京勤邦生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測多菌靈的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用，可定性、定量檢測煙葉中多菌靈藥物的殘留量。

背景技術(shù)

我國是生產(chǎn)和使用化學(xué)農(nóng)藥的大國，長期使用農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境以及人體健康的危害和影響已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注。多菌靈[carbendazim，N-(2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯]為苯并吡唑類，是一種良好的廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，對子囊菌、擔(dān)子菌以及半知菌類中的大多數(shù)病原菌都有效，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物以及中草藥的病害防治工作中。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能被植物的種子、根和葉吸收，殘效期較長，對人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、惡心嘔吐、胸悶、頭暈等中毒癥狀。因此，有關(guān)多菌靈殘留量的分析已經(jīng)越來越受到重視。

由于多菌靈在農(nóng)作物病害的防治方面有著廣泛的應(yīng)用，但其對人體又有一定的毒害性，目前世界許多國家都制定了多菌靈在不同種(類)農(nóng)副產(chǎn)品中殘留量的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。加拿大國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定黃瓜、西葫蘆等蔬菜中多菌靈殘留量每公斤不得超過0.5 mg；馬來西亞規(guī)定蔬菜類中多菌靈殘留量每公斤不得超過1 mg；我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14870294中規(guī)定蔬菜、水果中多菌靈殘留量每公斤不得超過0.5 mg。但目前尚無簡單、快捷的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供一種能夠檢測煙葉中多菌靈藥物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法，應(yīng)用本發(fā)明的酶聯(lián)免疫法測定煙葉中多菌靈藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明的試劑盒包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、多菌靈抗體、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液，所述包被原為多菌靈偶聯(lián)抗原，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記的多菌靈抗抗體，所述多菌靈偶聯(lián)抗原是由多菌靈半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述多菌靈半抗原是由多菌靈和三氟乙酸酐、硝酸銨反應(yīng)得到。

所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白。

所述多菌靈半抗原分子結(jié)構(gòu)式為：

。

所述多菌靈抗體是以多菌靈偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述多菌靈抗體為多菌靈單克隆抗體或多菌靈多克隆抗體，其中優(yōu)選多菌靈單克隆抗體。

所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)二抗是由酶和多菌靈抗抗體偶聯(lián)得到的。

為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液。

所述多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 μg/L、0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.9 μg/L，2.7 μg/L，8.1 μg/L。

當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為1~2 mol/L的硫酸溶液或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1~2 mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優(yōu)選為pH值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01‰~0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1~0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液，其中的百分比為重量體積百分比，單位g/mL。

所述復(fù)溶液優(yōu)選為pH值為7.0、0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液。

其中在酶標(biāo)板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1~7.5，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20 μg/mL，每孔加入100 μL，25℃避光孵育2 h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150~200 μL封閉液，25℃避光孵育1~2 h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發(fā)明的檢測原理為：

本試劑盒采用直接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的多菌靈和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗多菌靈的酶標(biāo)二抗，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物多菌靈的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中多菌靈的殘留量。