[發明專利]檢測多菌靈的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201510973048.5
• 申請日: 2015-12-23
• 公開（公告）號: CN105403703B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 范子彥;陳黎;魯亞輝;羅曉琴;潘立寧;胡斌;唐綱嶺;劉惠民;趙正苗
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院;國家煙草質量監督檢驗中心;北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種檢測多菌靈酶聯免疫試劑盒的制備方法，其特征在于：包括制備包被有包被原的酶標板、多菌靈標準品溶液、多菌靈抗體、酶標二抗、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為多菌靈偶聯抗原，所述酶標二抗為酶標記的多菌靈抗抗體，所述多菌靈偶聯抗原是由多菌靈半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述多菌靈半抗原的具體制備方法如下：

三氟乙酸20 mL 加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴，降至0℃，加硝酸銨0.5 g，攪拌1 h，加入含多菌靈1.0 g 的三氟乙酸溶液，繼續攪拌，反應2 h；停止反應，加稀氫氧化鈉溶液中和到中性，二氯甲烷萃取，水洗，蒸干，乙醚洗滌結晶，得到化合物a 0.76 g，收率67%；化合物a 0.7 g 加乙醇溶解，加0.43 g 氯化錫水溶液10 mL，通入氮氣，加入回流反應3 h；停止反應，旋蒸除去乙醇，加乙酸乙酯萃取，濃縮上硅膠柱，石油醚和乙酸乙酯的體積比為1：1洗脫分離，得到半抗原化合物產物0.54 g，收率，83%；

所述多菌靈半抗原分子結構式為：

。

2.如權利要求1 所述試劑盒的制備方法，其特征在于：所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白。

3.如權利要求1 所述試劑盒的制備方法，其特征在于：所述多菌靈抗體是以多菌靈偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述多菌靈抗體為多菌靈單克隆抗體或多菌靈多克隆抗體。

4.如權利要求1 所述試劑盒的制備方法，其特征在于：所述酶標二抗的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為1~2 mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為1~2 mol/L氫氧化鈉。

5.如權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于：所述洗滌液為pH值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01‰~0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1~0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述復溶液為pH值為7.0、0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液，洗滌液中的百分比為重量體積百分比，單位g/mL。

6.如權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于：所述多菌靈標準品溶液的濃度分別為0 μg/L、0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.9 μg/L，2.7 μg/L，8.1 μg/L。

7.一種權利要求1 所述方法制備的試劑盒檢測煙葉樣品中多菌靈含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）樣品前處理；

（2）用試劑盒進行檢測；

（3）分析檢測結果。