[發明專利]檢測三唑醇的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201510973025.4
• 申請日: 2015-12-23
• 公開（公告）號: CN105572348B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 陳黎;范子彥;曹東山;魯亞輝;潘立寧;胡斌;唐綱嶺;劉惠民;朱亮
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院;國家煙草質量監督檢驗中心;北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測三唑醇的酶聯免疫試劑盒，其特別適于煙葉中三唑醇殘留量的檢測。

背景技術

三唑醇（triadimenol，C₁₄H₁₈CN₃O₂）又名百擔，化學名稱為1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是一種低毒、廣譜、高效的內吸性殺菌劑，其主要作用機理是抑制赤霉素和麥角固醇的生物合成進而影響細胞分裂速率，對煙草根黑腐病、白粉病、蛙眼病等真菌病害都有很好的防治效果。因此，在我國農業生產中的應用非常廣泛，適用于麥類、玉米、高粱、果蔬、煙草等農作物。

煙草中三唑醇殘留是國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）密切關注的，且近年來在我國某些產地煙草中的檢出率也較高。隨著三唑醇的廣泛使用和人們對食品和農作物安全的重視，三唑醇在食品及農作物中的殘留也受到了高度關注。2007年1月歐盟公布了進口的中國產蜂蜜中檢測出三唑醇殘留量超標的預警通報。同年5月，日本厚生勞動省查出我國1批輸日胡蘿卜中三唑醇殘留量超標，由此日方要求對我國出口日本的胡蘿卜中三唑醇項目實施50%監控檢查。目前，很多國家已明確限定該農藥在食品中的最高殘留限量，如日本規定三唑醇在食品中的殘留限量（MRL）為0.2~0.5mg/kg；歐盟規定三唑醇在豆類中的MRL為0.1mg/kg；國際食品法典委員會（CAC）規定西紅柿中三唑醇的MRL為0.5mg/kg。為避免三唑醇殘留對人體造成危害以及突破國外貿易壁壘，建立簡單、快速、準確、可靠的煙草中三唑醇類殘留量的檢測方法很有必要。

目前常用的三唑醇檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（LC）、氣-質聯用法（GC-MS）和液-質聯用法（LC-MS）。采用這些分析方法需要昂貴的儀器和專門的技術人員，樣品前處理過程復雜且花費高、費時長，難以滿足大量樣品和現場樣品快速檢測的需要。酶聯免疫吸附分析法（ELISA）具有簡便快速、特異靈敏、樣品容量大、分析成本低的特點，可以簡化甚至省去樣品凈化步驟，在大量樣本和現場樣本快速篩選檢測中顯示出獨特優勢，能夠更好地滿足我國企業、政府職能監管部門等開展檢測工作，極具發展潛力。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于三唑醇殘留量檢測的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣本篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有三唑醇偶聯抗原的酶標板、三唑醇單克隆抗體、酶標記抗抗體、三唑醇標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液；所述三唑醇偶聯抗原是由三唑醇半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白，所述三唑醇半抗原是由三唑酮與氨基己酸在有機堿1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯的催化下進行酮胺的縮合反應得到，分子結構式為：

。

所述三唑醇單克隆抗體是以三唑醇偶聯抗原作為免疫原制備獲得。

所述酶標記抗抗體中的抗抗體為羊抗鼠抗抗體。

所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括三唑醇標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述三唑醇標準品溶液6瓶，濃度分別為0 μg/L、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1~2 mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1~2 mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.05%吐溫-20、0.01‰硫柳汞防腐劑的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液，其中的百分比為質量體積百分比，單位g/mL。

所述復溶液優選為pH值為7.0、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液。