[發(fā)明專利]一種細(xì)菌計(jì)數(shù)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510971248.7
• 申請(qǐng)日: 2015-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105445169B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒小波;李志華;黃曉瑋;石吉勇;周煦成;胡雪桃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N15/10
• 分類號(hào): G01N15/10
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• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了一種細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，包括以下步驟，S1：利用電聚合法在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜；S2：繪制所述聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜修飾電極標(biāo)準(zhǔn)曲線；S3：根據(jù)所述步驟S2所得標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)菌液樣本的細(xì)菌濃度。本發(fā)明實(shí)施過(guò)程中無(wú)需對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，因此耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便；本發(fā)明以苯胺為主要試劑，待測(cè)液消耗量少，因此檢測(cè)費(fèi)用低、設(shè)備簡(jiǎn)單；本發(fā)明所述方法具有重復(fù)性好、檢測(cè)線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)；是一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，本發(fā)明是基于聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌菌體濃度的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于材料科學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。

背景技術(shù)

細(xì)菌菌體濃度的檢測(cè)在微生物發(fā)酵、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品質(zhì)量檢測(cè)等領(lǐng)域都具有重要意義。目前，常用的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法為培養(yǎng)法，包括平板計(jì)數(shù)法、MPN法等。

平板計(jì)數(shù)法是檢測(cè)菌落總數(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法(參考文獻(xiàn)見(jiàn)：GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S])，是判斷其他計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法對(duì)于平皿中的單菌落計(jì)數(shù)較準(zhǔn)確，但由于培養(yǎng)皿中菌落疏密不均勻地排列，依靠人工觀察粘連菌落并計(jì)數(shù)具有一定的主觀性且計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，整體來(lái)說(shuō)該方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大、效率低。

MPN是稀釋培養(yǎng)測(cè)數(shù)法：適用于檢測(cè)帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。MPN法是一種常見(jiàn)的間接計(jì)數(shù)法，但其存在一定的局限性。

這些培養(yǎng)法存在耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)菌操作要求嚴(yán)格，手續(xù)繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度大，受培養(yǎng)條件影響較大等不足。

為克服培養(yǎng)法的不足，多種計(jì)數(shù)方法被廣泛采用。其中相對(duì)可靠并被廣泛認(rèn)可的有熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法，其中熒光顯微鏡(Fluorescence microscope)計(jì)數(shù)法：熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀、所在位置及其數(shù)量。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法是通過(guò)激光對(duì)通過(guò)激光束的顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，當(dāng)顆?；蛘呒?xì)胞通過(guò)激光束的時(shí)候，會(huì)對(duì)光線產(chǎn)生折射和反射。這個(gè)折射和反射的信號(hào)被探測(cè)器記錄下來(lái)。每通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)峰值，最后記錄峰值的個(gè)數(shù)。

雖然這兩種方法具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但存在設(shè)備昂貴，使用和維護(hù)成本高等不足。因此，尋求一種操作簡(jiǎn)便、快速，成本低的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法具有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌菌體濃度的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，包括以下步驟:

S1：利用電聚合法在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜；

S2：繪制所述聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜修飾電極標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S3：根據(jù)所述步驟S2所得標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)菌液樣本的細(xì)菌濃度。

上述方案中，所述步驟S1具體包括以下步驟:

1)標(biāo)準(zhǔn)菌懸液準(zhǔn)備：

配制細(xì)菌培養(yǎng)液，高壓滅菌后接種適量菌種進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)后所獲得菌液離心清洗，便得到標(biāo)準(zhǔn)菌懸液；

2)細(xì)菌在玻碳電極表面的固定：

所述玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理后，測(cè)定其循環(huán)伏安曲線，直至氧化-還原峰電位差降至80mV以內(nèi)，將所述玻碳電極晾干；取所述標(biāo)準(zhǔn)菌懸液滴至玻碳電極表面后，經(jīng)烘干即可將細(xì)菌固定在所述玻碳電極表面；

3)苯胺在電極表面的聚合：

將上述固定有細(xì)菌的玻碳電極置于含有苯胺的硫酸溶液中采用循環(huán)伏安法掃描，苯胺在玻碳電極表面聚合得到聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜。