[發(fā)明專利]一種磁性殼聚糖微球固定化黃嘌呤氧化酶的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510971138.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN105543208A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任嬌艷;康小燕;劉丹;鄭亞美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及固定化酶領(lǐng)域，具體涉及一種磁性殼聚糖微球固定化 黃嘌呤氧化酶的制備方法。

背景技術(shù)

磁性材料是一種用途廣泛，歷史悠久的功能材料。早在3000年 以前，古人便將天然磁鐵作為指南針使用，在現(xiàn)代，磁性材料被用作 永磁馬達(dá)、磁軟盤、變壓器中的鐵心材料，作為存儲(chǔ)器使用的磁光盤， 計(jì)算機(jī)用磁記錄軟盤等等。磁性殼聚糖微球作為高分子材料與磁性材 料的復(fù)合物，一方面有著優(yōu)良的超順磁性，使其很容易在外加磁場(chǎng)下 實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向物質(zhì)的富集、分離和回收利用；另一方面，又可通過(guò)活化 修飾引入如醛基、羧基、環(huán)氧基等的功能性基團(tuán)而使其具有更多的功 能特性。這些性質(zhì)使磁性殼聚糖微球具有標(biāo)記、固定、引導(dǎo)和磁分離 的功能，從而在酶工程、細(xì)胞生物學(xué)、分離工程、分子生物學(xué)等領(lǐng)域 有著良好的發(fā)展前景。

近年來(lái)，關(guān)于磁性殼聚糖微球制備及其應(yīng)用的研究越來(lái)越廣泛， 尤其是在固定化酶方面。例如研究發(fā)現(xiàn)利用磁性殼聚糖磁性微球，用 于固定化血紅密孔菌漆酶(BiochemicalEngineeringJournal,2005, 25(1):15-23)、脂肪酶(BiomassandBioenergy,2012,36:373-80)及 纖維素酶(華南理工大學(xué)2012年碩士學(xué)位論文)，可使酶的熱穩(wěn)定性、 pH穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及酶的工作效率等得到很大 程度的改善。

黃嘌呤氧化酶/脫氫酶廣泛存在于植物(小麥、豌豆苗、擬南芥 等)、動(dòng)物(牛奶、小鼠乳腺及肝臟等)及微生物(節(jié)桿菌、鏈霉菌、 光合細(xì)菌等)中，是一種含鉬、無(wú)機(jī)硫化物、非血紅素鐵的黃素酶， 能夠催化次黃嘌呤、黃嘌呤生成尿酸，直接調(diào)控著體內(nèi)尿酸水平的高 低，是體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶。黃嘌呤氧化酶作為一種重要的代謝調(diào) 控酶，在醫(yī)學(xué)診斷及工業(yè)應(yīng)用中具有遠(yuǎn)大前景，但游離酶較差的穩(wěn)定 性直接影響其應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性的研究主要集中于改變?nèi)芤涵h(huán) 境提高其穩(wěn)定性，對(duì)固定化方法的研究較少。張玉然等用修飾的瓊脂 糖介質(zhì)及大孔陰離子交換樹脂固定化黃嘌呤氧化酶，發(fā)現(xiàn)以谷氨酸為 連接臂的瓊脂糖介質(zhì)(Sepharose-Glu)固定化效果最佳，酶活回收率 達(dá)到15.5％(食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,33(1):16-21)。陳國(guó)南等研 究以黃嘌呤氧化酶修飾的電加熱碳糊電極，發(fā)現(xiàn)電極的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度與次黃嘌呤的濃度呈線性關(guān)系，另外，不同于一般的溫敏電極，該 電極的溫度是可控的(AnalyticalChemistry,2008,80(8):2826-2831)。 RafaelRadi等將黃嘌呤氧化酶固定在由鋰皂石納米顆粒構(gòu)成的玻碳 電極上進(jìn)行電化學(xué)研究，所制備的固定化酶不僅保留其生物活性，而 且顯示良好的電化學(xué)性能(BiosensorsandBioelectronics,2009,24(12): 3556-3561)。

專利公開號(hào)為CN1368552A的專利公開了“一種可見光交聯(lián)復(fù)合 樹脂固定黃嘌呤氧化酶活性細(xì)胞的方法”，公開日期為2002年9月 11日，申請(qǐng)人為武漢大學(xué)。該方法以可見光交聯(lián)復(fù)合樹脂作為載體， 將黃嘌呤氧化酶活性細(xì)胞包埋于其中，經(jīng)可見光照射，制備了固定化 細(xì)胞。制備的固定化細(xì)胞具有抗微生物分解性能好，機(jī)械強(qiáng)度高，化 學(xué)性能穩(wěn)定，重復(fù)反應(yīng)穩(wěn)定性高，酶活保留高等方面的優(yōu)點(diǎn)。

專利公開號(hào)為CN1834241A的專利公開了“一種固定化黃嘌呤氧 化酶及其制備方法和用途”，公開日期為2006年9月20日，申請(qǐng)人 為武漢大學(xué)。方法如下：將碳納米管開管氧化，用水洗滌至中性并烘 干，將烘干后的碳納米管和雙十六烷基磷酸加入蒸餾水中，超聲分散 得分散液；將分散液涂附在基體上，烘干，得到混合膜；將混合膜放 入黃嘌呤氧化酶溶液吸附，得到固定化黃嘌呤氧化酶。該專利的突出 特點(diǎn)是能同時(shí)得到黃嘌呤氧化酶三對(duì)氧化還原中心的電化學(xué)信號(hào)，并 且黃嘌呤氧化酶保持其生物活性，能催化其底物-硝酸根的還原，有 較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

專利公開號(hào)為CN103558306A的專利公開了“一種篩選黃嘌呤氧 化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法”，公開日期為2014年2月5日， 申請(qǐng)人為中南大學(xué)。該專利通過(guò)戊二醛作為交聯(lián)劑，將黃嘌呤氧化酶 固定在氨基化的四氧化三鐵納米粒子表面，得到黃嘌呤氧化酶修飾的 磁性納米四氧化三鐵粒子，用于快速篩選中草藥中抑制黃嘌呤氧化酶 的活性物質(zhì)。