[發明專利]一種DNA片段的拼接方法

有效

• 申請號: 201510968195.3
• 申請日: 2015-12-21
• 公開（公告）號: CN105483188B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 李威;趙斯斯;何曉銳
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

本發明提供了一種核酸片段的拼接方法，通過提供一種設計有同源臂及特定酶切位點的DNA載體；提供多個帶有同源臂且相鄰拼接位置的目標DNA片段首尾相互重疊的待拼接的目標DNA片段；利用無縫克隆將多個待拼接的目標DNA片段一并克隆入所述的DNA載體，從而獲得含有更長DNA片段的載體。本發明的方法獲得的片段又可以以同樣的方式與其他片段進行排接，從而可以源源不斷地將更多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物學中得到大段的DNA片段非常適用。

技術領域

本發明屬于分子生物學及生物工程技術領域，涉及一種在基因工程操作中的DNA片段克隆和拼接方法。具體地，本發明涉及一種將多個DNA片段首尾拼接形成更長的DNA片段的方法及該方法的應用。

背景技術

DNA(Deoxyribonucleic acid)，又稱脫氧核糖核酸，是生命體內重要的遺傳物質，也是生命科學和生物技術研究的重要對象和工具。隨著基因工程技術和應用的發展，在體外對DNA的操作方式越來越多，比如對DNA分子的擴增、切割、修飾與重新組裝等，也稱為重組DNA技術，是現代分子生物學發展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技術。

在這些體外DNA操作中，有一個重要的環節是將DNA片段連接到載體中，從而可以利用生物(細菌、酵母、細胞等)對DNA進行擴增、篩選、表達等操作。將DNA片段連接到載體的過程也稱為狹義的DNA克隆。

可以作為DNA載體的有質粒、粘粒、噬菌體、人工染色體等，其中質粒載體是應用最為廣泛的分子克隆載體。

實現DNA片斷克隆到載體中的方法也有多種。比如酶切連接的方法，即DNA分子的切割與連接可以通過限制性內切酶和連接酶來完成，即分別用相應的限制性內切酶切割目標DNA分子和載體DNA分子，使其兩端分別獲得含有部分單鏈突出的末端(粘性末端)，含有互補序列的末端(由同一個酶或同尾酶切割獲得)在DNA連接酶的作用下形成一條完整的DNA鏈。也有TA克隆的方法，即在DNA片段末端各添加一個3’-dA堿基，在載體末端各添加一個3’-dT堿基，即可實現DNA片段與載體的連接。還有基于同源片段的連接方法，即在片段和線性化的載體兩端分別有相同的序列，通過酶的作用將其連接在一起。

實現單個DNA片段與載體的連接的方法相對比較簡單和成熟。如上所述的方法中，分別用一個步驟即可完成。在研究中，尤其是合成生物學應用中，經常需要用到將多個片段連接到一起形成一個更長的DNA分子的過程，通常的方法，可以先將多個片段通過PCR的方法連接到一起，再克隆連接到載體中。也可以先將其中的一個片段克隆到載體中，形成新的載體后再加入新的片段。但這些方法都存在明顯的缺點，PCR的方法得到的序列存在一定的突變率，往往需要重新篩選正確克隆，而且PCR方法所能操作的DNA片段數量和長度都有限。先后加入的方法，一方面受酶切位點的限制，隨著片段的增加，可選的酶切位點越來越少，另外一方面，遇到片段比較多的時候，該方法需要比較長的時間。

為了解決多個片段拼接的問題，尤其是大量DNA片段需要拼接形成較長的DNA分子的問題。本發明提出了一種“遞歸”克隆的方法，根據該方法設計的載體和片段，可以方便地，并行和遞歸地將多個DNA片段首尾拼接，形成大的DNA分子。

發明內容

本發明的目的在于提供一種將多個DNA片段首尾拼接形成更長的DNA片段的方法。

一種將多個DNA片段拼接形成更長的DNA片段的拼接方法，包括下列步驟：

1)提供一種DNA載體，所述載體上至少順序包含四個不同的酶切位點，即酶切位點A、酶切位點B、酶切位點C和酶切位點D，其中，酶切位點A和酶切位點B之間設有載體左同源臂，酶切位點C和酶切位點D之間設有載體右同源臂；