[發明專利]一種DNA片段的拼接方法有效
| 申請號： | 201510968195.3 | 申請日： | 2015-12-21 |
| 公開（公告）號： | CN105483188B | 公開（公告）日： | 2019-04-23 |
| 發明（設計）人： | 李威;趙斯斯;何曉銳 | 申請（專利權）人： | 生工生物工程（上海）股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/09 | 分類號： | C12N15/09 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 吳開磊 |
| 地址： | 201611 上海*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 dna 片段 拼接 方法 | ||
1.一種DNA片段的拼接方法，包括下列步驟：
1)提供一種DNA載體，所述載體上至少順序包含四個不同的酶切位點，即酶切位點A、酶切位點B、酶切位點C和酶切位點D，其中，酶切位點A和酶切位點B之間設有載體左同源臂，酶切位點C和酶切位點D之間設有載體右同源臂；
2)提供多個待拼接的目標DNA片段，相鄰拼接位置的目標DNA片段首尾相互重疊，且首個待拼接目標DNA片段的首部設有與步驟1)所述DNA載體的載體左同源臂同源的左臂序列，末個待拼接片段的尾部設有與步驟1)所述DNA載體的載體右同源臂同源的右臂序列；
3)將步驟2)所述的多個待拼接的目標DNA片段經無縫克隆的方法一并克隆入步驟1)所述的DNA載體，獲得的載體中，所述多個待拼接的目標DNA片段按照設計的拼接順序相連；
所述酶切位點A、酶切位點B、酶切位點C和酶切位點D順次分別為限制性內切酶Sbf I、Bpi I、Esp3I和AsiS I的酶切位點；
其中，步驟1)所用的DNA載體的序列為SEQ ID NO:15；步驟1)所述的DNA載體被限制性內切酶B和限制性內切酶C酶切線性化；
步驟2)中，至少一個待拼接的目標DNA片段采用包括下列步驟的方法獲得：
a)提供兩端附加有與步驟1)提供的DNA載體中所述載體左同源臂同源的左臂序列及與所述載體右同源臂同源的右臂序列的待拼接的目標DNA片段；
b)將步驟a)的片段經無縫克隆的方法克隆入步驟1)提供的DNA載體中，獲得克隆有待拼接的目標DNA片段的載體；
c)將步驟b)獲得的載體擴增后，經內切酶A和內切酶C酶切，或內切酶B和內切酶D酶切，或內切酶B和內切酶C酶切獲得所述待拼接的目標DNA片段；
步驟c)中，當所述載體克隆有首個待拼接目標DNA片段時，采用內切酶A和內切酶C酶切；當所述載體克隆有末個待拼接目標DNA片段時，采用內切酶B和內切酶D酶切；若待拼接目標DNA片段數目超過兩個，當所述載體克隆有中間待拼接目標DNA片段時，采用內切酶B和內切酶C酶切；
所述方法還包括：4)將步驟3)獲得的DNA載體酶切分離拼接完成的DNA片段；
將步驟4)獲得的拼接完成的DNA片段作為待拼接的目標DNA片段，進一步拼接更長的DNA片段。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體左臂同源序列及載體右臂同源序列的長度為15-100bp。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，相鄰拼接位置的目標DNA片段首尾相互重疊的區域為15-100bp。
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