[發明專利]大腸桿菌O111檢測用的引物和探針組、試劑盒及PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201510967445.1
• 申請日: 2015-12-18
• 公開（公告）號: CN105779584A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 游淑珠;蔡教英;姚麗鋒;馮家望;王小玉;唐食明;鄺筱珊;蔣聯振;符家忍;趙宇清
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

1.一種大腸桿菌O111檢測用的引物和探針組，其特征在于，它是由下述 引物和探針組成：

上游引物：GAGGGAAATGTGTTAGATG；

下游引物：GTTGGGATTGTTAATTTGTTA；

探針：FAM-TTCTTCAATTAACTGGTGGCGTCTC-BHQ1。

2.一種含有權利要求1所述大腸桿菌O111檢測用的引物和探針組的檢測 試劑盒，其特征在于，它的組成如下：

上游引物，濃度為10μmol/L；

下游引物，濃度為10μmol/L；

探針，濃度為10μmol/L；

dNTPs，濃度為10mmol/L；

PCR緩沖液，濃度為10×；

TaqDNA聚合酶，濃度為5U/μL；

其中，大腸桿菌O111的引物和探針指的是：

上游引物：GAGGGAAATGTGTTAGATG；

下游引物：GTTGGGATTGTTAATTTGTTA；

探針：FAM-TTCTTCAATTAACTGGTGGCGTCTC-BHQ1。

3.根據權利要求2所述的一種大腸桿菌O111檢測用的引物和探針組的檢 測試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括陽性對照物和陰性對照物，所述 陽性對照物是濃度為30ng/μL的大腸桿菌O111的標準DNA溶液，所述陰 性對照物是去離子水。

4.一種采用權利要求2所述試劑盒，用于檢測大腸桿菌O111的檢測方法， 其特征在于，包括以下步驟：

1)、待檢樣品模板DNA的提取

待檢樣品用增菌肉湯進行培養，獲得增菌肉湯，取待1mL檢增菌液， 7000g離心2min，盡量吸棄上清；

加入80μLDNA提取液，混勻后沸水浴10min，置冰上10min；

7000g離心2min，取上清液作為待檢模板DNA；

2)、進行實時熒光PCR擴增反應

配置實時熒光PCR反應體系，每25μL體積的實時熒光PCR反應體 系具體為：

按下述實時熒光PCR反應體系配制，在反應管中加入PCR緩沖液、 去離子水、DNA聚合酶、引物和探針，混勻，然后加入待檢模板DNA；

熒光PCR反應體系為：

組分 工作液濃度 加樣量(μL) 上游引物 10μmol/L 1 下游引物 10μmol/L 1 探針 10μmol/L 1 dNTPs 10mmol/L 1 PCR緩沖液 10× 2.5 Taq DNA聚合酶 5U/μL 0.5 待檢模板DNA / 2 去離子水 / 17

將實時熒光PCR反應體系置于實時熒光PCR儀中，按下述反應條件 進行實時熒光PCR反應：

95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃退火1min，40個循環；

其中，大腸桿菌O111的引物和探針指的是：

上游引物：GAGGGAAATGTGTTAGATG；

下游引物：GTTGGGATTGTTAATTTGTTA；

探針：FAM-TTCTTCAATTAACTGGTGGCGTCTC-BHQ1。

5.根據權利要求4所述檢測大腸桿菌O111的檢測方法，其特征在于，所 述步驟1)中待檢樣品模板DNA的提取還可采用商品化的DNA提取試劑 盒。