[發明專利]應用于斑馬魚胚胎的先加標簽的染色質免疫共沉淀高通量測序實驗方法

在審

• 申請號: 201510967007.5
• 申請日: 2015-12-21
• 公開（公告）號: CN105463090A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 劉桂芬;張勇;陳韻如;胡圣恩;曾詩揚;陳曉蘭
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 上海科律專利代理事務所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 葉鳳

技術領域

本發明屬于分子生物學高通量實驗技術領域，主要用于研究斑馬魚早期胚胎發育 過程中全基因組染色質修飾動態變化及相關基因轉錄機制研究。

背景技術

胚胎發育一直是生命科學研究的主題之一。從一個單細胞發育成一個多細胞的個 體，是許多基因和蛋白質在時間和空間上順序表達的結果。其中染色質修飾在胚胎發育過 程中扮演著重要的角色，但是關于其在發育過程中的動態變化研究比較少，斑馬魚為生物 體的發育研究提供好很好的模型，但是實驗技術限制阻礙了很好的研究發育各個階段染色 質修飾的動態變化。傳統的染色質免疫共沉淀(ChIP)雖然也能觀察每個時期的染色質修飾 的水平，間接觀察其動態變化，但是由于早期胚胎發育過程中，細胞數量少，很難達到實驗 要求。index-firstchromatinimmunoprecipitation(iChIP)是在傳統的ChiP上進行的改 良，這種方法是通過在染色質免疫共沉淀前先將每個樣本進行標記后再將所有樣品混合在 一起進行實驗，這樣可以在一次實驗中完成所有時期的實驗，比較好的能觀察到在發育過 程中染色質修飾的一個動態變化，減少了早期細胞量少可能造成的實驗偏差，且可以通過 細胞數的量實驗對整個發育過程中的染色質修飾的動態變化進行定論觀察。

斑馬魚由于養殖容易，繁殖周期短，產卵量大，胚胎透明等諸多優點，近年來已成 為研究脊椎動物發育與人類疾病的新興模式動物。研究發現斑馬魚共享了人類70％的蛋白 編碼基因，而且人類相關基因中有84％可以在斑馬魚中找到對應基因，另外在斑馬魚系統 中開發除了阻斷基因功能的工具－morpholino，而且隨著CRISPR/Cas9技術的日益成熟，可 快速逆向遺傳學手法來驗證基因的功能，為我們揭開人類發育的生物學奧秘提供依據。

目前iChIP-seq技術只是用于細胞樣本中，對于染色質修飾的動態變化及與基因 表達的關系研究也只限于細胞水平，還未有報道在斑馬魚的胚胎細胞中應用。

發明內容

本發明的目的為了研究斑馬魚早期胚胎發育過程中的染色質各種修飾的動態變 化及與基因表達調控的關系所建立的應用于斑馬魚胚胎的一種先加標簽的染色質免疫共 沉淀高通量測序(iChIP-seq)實驗方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

應用于斑馬魚胚胎的一種先加標簽的染色質免疫共沉淀高通量測序(iChIP-seq) 實驗方法，該方法包括以下步驟：

(1)斑馬魚胚胎樣本前處理：

取200個胚胎于2ml離心管中，用預冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul(1％甲醛 為270ul37％甲醛加4.73mlPBS稀釋配置)搖床輕搖交聯3min，加200ul1.25M甘氨酸搖床 輕搖5min終止交聯。

(2)斑馬魚胚胎細胞核裂解：

經過前處理的斑馬魚胚胎樣品再用PBS加蛋白抑制劑洗滌3次，最后一次盡量將液 體吸干凈。加入1ml預冷的裂解緩沖液10mMTris-HClpH7.5，10mMNaCl，0.5％NP-40(加蛋 白抑制劑)，用1ml廣口的移液器槍頭冰上反復吹打胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3-4min， 直至裂解液變清，離心收集細胞核，用1mlPBS(加蛋白抑制劑)重懸細胞核于新的1.5ml的離 心管中，4度，3500rpm離心5min去上清。

(3)微球菌酶(MNase)酶切反應：

用200ul消化緩沖液50mMTris-ClpH7.6，1mMCaCl2，0.2％TritonX-100或NP-40 (加蛋白抑制劑)重懸細胞核，25度預熱2min，加稀釋好的MNase于離心管中輕輕混勻，25度 反應5-10分鐘。MNase酶稀釋：取2ul0.4U/ulMNase酶于8ulMNase稀釋緩沖液(50mMTris- ClpH8，10mMNaCl，126mMCaCl2，5％甘油)混勻后，再取4ul于28ulMNase稀釋緩沖液中共稀 釋40倍。

(4)終止反應及超聲片段化DNA