[發(fā)明專利]應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎的先加標(biāo)簽的染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510967007.5
• 申請(qǐng)日: 2015-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105463090A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉桂芬;張勇;陳韻如;胡圣恩;曾詩(shī)揚(yáng);陳曉蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 同濟(jì)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 上海科律專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 葉鳳

1.應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎的先加標(biāo)簽的染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測(cè)序(iChIP-seq)實(shí)驗(yàn)方 法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)斑馬魚(yú)胚胎樣本前處理：

取200個(gè)胚胎于2ml離心管中，用預(yù)冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul搖床輕搖交聯(lián) 3min，加200ul1.25M甘氨酸搖床輕搖5min終止交聯(lián)；

(2)斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞核裂解：

經(jīng)過(guò)前處理的斑馬魚(yú)胚胎樣品再用PBS加蛋白抑制劑洗滌3次，最后一次盡量將液體吸 干凈。加入1ml預(yù)冷的裂解緩沖液(加蛋白抑制劑)，用1ml廣口的移液器槍頭冰上反復(fù)吹打 胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3-4min，直至裂解液變清，離心收集細(xì)胞核，用1mlPBS(加蛋 白抑制劑)重懸細(xì)胞核于新的1.5ml的離心管中，離心去上清；

(3)微球菌酶(MNase)酶切反應(yīng)：

用200ul酶切消化緩沖液(加蛋白抑制劑)重懸細(xì)胞核，25度預(yù)熱2min，加稀釋好的 MNase于離心管中輕輕混勻，25度反應(yīng)5-10分鐘；

(4)終止反應(yīng)及超聲片段化DNA

反應(yīng)結(jié)束后立即加入200ulMNase終止緩沖液，輕輕混勻后，biorupt超聲4*30sec，離 心10min，取50ul上清加50ulGilchrist終止緩沖液，65度90分鐘解交聯(lián)，加1ml無(wú)水乙醇， 40ul3MpH5.3NaAc，-80度沉淀后Qiagen試劑盒純化得inputDNA；

(5)透析及磁珠平衡：

將剩下的上清液轉(zhuǎn)至透析卡中，于透析緩沖液ChIPbuffer中輕搖2h，4度。每個(gè)樣品取 15ulDynabeadsProteinG，用PBS加BSA5mg/ml洗滌平衡3次備用；

(6)染色質(zhì)固定：

透析結(jié)束吸出透析卡中的染色質(zhì)離心取上清，轉(zhuǎn)至低吸附的離心管中，加入提前準(zhǔn)備 好的磁珠，加1.3ugH3抗體，4度輕搖孵育20h，然后用150ul10mMTrisCl(加蛋白抑制劑) 洗滌3次，每次于4度輕搖5min；

(7)染色質(zhì)標(biāo)記：

20ul上述液體重懸磁珠，加25ul2*ER混合緩沖液，2ulT4PNK酶，2ulT4聚合酶，低吸附 槍頭混勻，于熱循環(huán)儀器中12度25min，25度25min，4度；末端修復(fù)完成后用150ulTrisCl (加蛋白抑制劑)洗滌一次，然后用上述液體42ul重懸磁珠，加5ul10*NE緩沖液，2ul Klenow，1uldATP，低吸附槍頭混勻，37度反應(yīng)30min，再次用150ulTrisCl(加蛋白抑制 劑)洗滌一次，用18ul上述液體重懸磁珠，加25ul2*快速連接緩沖液，5ul快速連接酶，5ul 0.75uMY-型indexed接頭，低吸附槍頭混勻，25度反應(yīng)40min，再用150ulTrisCl(加蛋白 抑制劑)洗滌一次；

(8)染色質(zhì)釋放及磁珠平衡：

每個(gè)樣品中加12.5ul100mMDTT，振蕩混勻，室溫孵育5min，然后再加12.5ul染色質(zhì)釋 放緩沖液(加蛋白抑制劑)，然后將所有樣品混合在一起，37度孵育震蕩30min，磁力架上取 上清，轉(zhuǎn)至30KD蛋白濃縮管中，用TE緩沖液補(bǔ)至體積為500ul，離心20min，然后將蛋白濃縮 管倒放至新的離心管中收集濃縮后的染色質(zhì)；每個(gè)樣品取50ulProteinG磁珠，用PBS加 5mg/mlBSA洗滌平衡三次備用；

(9)染色質(zhì)免疫共沉淀：

將上述濃縮后的染色質(zhì)轉(zhuǎn)至低吸附離心管中，加440ul水，150mMNaCl，0.5％Tx-100， 加上述平衡后的磁珠，加組蛋白修飾抗體，4度孵育3h；

(10)洗滌及iChIPedDNA洗脫

用磁力架去除上清，用200ul預(yù)冷的RIPA緩沖液洗滌5次，RIPA緩沖液加350mMNaCl洗 滌兩次，LiCl緩沖液洗滌兩次，TE緩沖液洗滌1次，以上洗滌每次8min；然后加50ul洗脫緩沖 液加2ulRNaseA，37度洗脫30分鐘，轉(zhuǎn)上清至新的離心管中加2.5ul蛋白酶K，65度解交聯(lián) 過(guò)夜，磁珠重復(fù)洗脫一次，體積共100ul；

(11)純化及建庫(kù)測(cè)序

解交聯(lián)過(guò)夜DNA用AMPure磁珠純化，24ul無(wú)核酶水洗脫；Qubit對(duì)iChIP下來(lái)的樣品進(jìn)行 定量，然后加上下游引物及PCR混合液擴(kuò)增建庫(kù)，再用AMPure磁珠去除引物二聚體， bioanalyzer檢查文庫(kù)質(zhì)量，Hiseq2500的125PE進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。