[發明專利]一種解鏈式水解探針實時熒光PCR

在審

• 申請號: 201510961208.4
• 申請日: 2015-12-22
• 公開（公告）號: CN105400886A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發明（設計）人: 岳素文;何玉貴;江洪
• 申請（專利權）人: 北京泰格瑞分子檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于分子生物學及核酸擴增PCR技術領域，具體涉及一種解鏈式水解探針及實時熒光PCR技術。

背景技術：

核酸擴增PCR技術是隨著現代分子生物學的進步而一起發展、成熟的，早在1953年，核酸DNA雙螺旋模型及其中心法則開創了現代分子生物學及奠定了聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction，PCR)的基礎，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的KaryMullis在研究核酸測序方法時產生了核酸擴增的靈感：于試管中模擬天然的DNA體內復制過程。提供一種合適的條件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經過一系列探索、發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的發明、應用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發明專利(USPatent4,683,202)。

PCR技術以其獨有的高靈敏度、強特異性、簡便快速和純度要求低的特點而成為生命科學研究的核心基礎技術。但傳統的PCR(又稱為終末PCR)需將產物凝膠電泳檢測進行結果分析，傳統的PCR由于PCR產物量變異大的局限性，只能檢測反應終末產物的定性而不能精確定量，同時也沒有解決氣霧膠污染、引物二聚體、非特異性擴增等難題，因此傳統的PCR結合產物凝膠電泳檢測方法不適用于臨床檢驗等應用檢測。1992年Higuchi等首次提出了采用動態PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數量進行分析，為解決傳統PCR的難題提出了新思路。1996年由美國AppliedBiosystems公司推出實時熒光定量PCR技術，所謂實時熒光定量PCR技術，是指實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產物量(產物標記熒光強度)與起始靶基因量直接相關而定量。擴增產物量增加的熒光信號達到對數期的循環數Ct值(Cyclethreshold)與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關線性關系。即起始模板稀釋一倍達到同樣對數期熒光強度所需的擴增循環就要增加一個循環數(Ct)。該技術實行完全閉管式操作，避免了傳統PCR開蓋引起的產物污染問題，減少了假陽性結果的出現，同時也避免了對環境的污染。相比于傳統PCR電泳的方法，該技術操作簡便，檢測結果以更客觀的數據形式展現，從而對樣本進行陽性、陰性和可疑的判定，保證了結果的準確性。

實時熒光定量PCR擴增產物增加的信號既可通過染料法來顯示，又可采用帶淬滅基團的探針法來檢測。染料法即在PCR反應體系中，加入過量熒光染料(如SYBRGreenI)，熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。非特異的染料法成本較低，但面臨著類似于傳統PCR非特異性擴增產物干擾的假陽性問題。探針法即PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。與染料法相比，探針法在一定程度上避免了假陽性問題的出現，其特異性有引物和探針雙重保證，進一步增加了結果的可信度。