[發明專利]一種解鏈式水解探針實時熒光PCR

在審

• 申請號: 201510961208.4
• 申請日: 2015-12-22
• 公開（公告）號: CN105400886A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發明（設計）人: 岳素文;何玉貴;江洪
• 申請（專利權）人: 北京泰格瑞分子檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征是借鑒MolecularBeacon首尾自身結合的一種兩兩相互結合并隨擴增產物解鏈的TaqMan熒光探針及PCR技術；其關鍵是探針5’端熒光基團標記的常規堿基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解產生熒光，3’端靶序列外添加5～8個與5’端3～14個堿基之后的中部序列反向互補的人為堿基再標記淬滅熒光基團的新性能探針實時熒光PCR檢測技術，以減少實時熒光定量PCR的本底非特異性。

2.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的解鏈式探針是指模板序列探針5′末端標記熒光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解；3’端靶結合序列外添加5～8個與5’端4～10個堿基之后的中部序列反向互補的人為堿基再標記淬滅熒光基團，由于環狀結合部分較短雜交使自身較難形成鍋柄樣結構，但兩探針兩段結合力大而很容易互補結合，這樣不僅加強抑制本底熒光，也規避了探針與過量引物間形成非特異性雜交延伸的聚合體，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan靈敏、特異的優點。

3.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的熒光探針設計策略原則是：首先選取一段小于40nt的靶熒光探針序列并遵守一般常規熒光探針設計所有原則，再在其3′末端多加5-8個與5’端4～10個堿基之后的中部序列反向互補的人為堿基，且在最末端標記淬滅劑TAMRA(6-羧基-四甲基-羅丹明rhodamine)、DABCYL或BHQ1等，則探針5′端可選擇標記熒光素FAM、HEX或TET。

4.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的實驗條件同于一般常規TaqMan探針實時熒光PCR反應體系；為了更進一步增加擴增特異性和減少循環前低溫非特異性反應，聯合采用各種熱啟動DNA聚合酶，化學修飾耐熱聚合酶或加熱緩釋Mg²⁺緩沖液等各種PCR優化方法，將更加極大地完善本發明一種解鏈式水解探針實時熒光PCR質量。

5.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的引物采用中部5-8個堿基同序的引物對以減少引物二聚體PD程度，從而減少對靶擴增的競爭性抑制，提高靈敏度。

6.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的PCR反應液加等體積的礦物油單獨使用，封閉反應液，不聯用熱蓋條件。

7.根據權利要求1所述的一種解鏈式水解探針實時熒光PCR，其特征在于，所述的技術用于基因檢測試劑盒，盒成份包括：核酸提取試劑，5mMdNTPs，TaqDNA聚合酶及其緩沖液，熒光探針，上游引物F/下游引物R，標準對照物，純化水dH₂O，礦物油。