[發(fā)明專利]一種魔芋基因組含量值的快速測(cè)定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510959683.8
• 申請(qǐng)日: 2015-12-21
• 公開（公告）號(hào): CN105606518A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛佳婧;刁英;鐘琳;胡中立
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種魔芋基因組含量值的快速測(cè)定方法。

背景技術(shù)

魔芋（Amorphophallus）屬天南星科（Areaceae）魔芋屬多年生草本植物，主要栽培種為花魔芋（Amorphophalluskonjac）、白魔芋（Amorphophallusalbus）、田陽(yáng)魔芋（AmorphophalluscorrugatusN.E.Brown）、西盟魔芋（AmorphophalluskrauseiEngler）、攸樂魔芋（AmorphophallusyuloensisH.Li）和勐海魔芋（AmorphophalluskachinensisEngl.EtGenrm）六種，廣泛分布于湖北、云南、四川等長(zhǎng)江流域。魔芋的變態(tài)莖宿存于地下，通常呈球形、扁球形或柱狀球形，營(yíng)養(yǎng)十分豐富，含淀粉35%，蛋白質(zhì)3%，以及多種維生素和鉀、磷、硒等礦物質(zhì)元素，還含有人類所需要的魔芋多糖，即葡萄甘露聚糖達(dá)45%以上，并具有低熱量、低脂肪和高纖維素的特點(diǎn)。魔芋因其塊莖內(nèi)富含葡甘聚糖（Konjacglucomannan）、各種人體必需氨基酸和微量元素而廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健、農(nóng)業(yè)、化工、紡織、石油鉆探等領(lǐng)域，具有極大的商業(yè)價(jià)值、食品價(jià)值與藥用價(jià)值。

目前關(guān)于魔芋的細(xì)胞學(xué)研究主要集中在染色體計(jì)數(shù)及核型分析上，國(guó)內(nèi)外報(bào)道魔芋的染色體數(shù)目為2n=24、26、28、32等，其中大部分為2n=26。近來韋松基和溫標(biāo)才報(bào)道了桂平魔芋（AmorphophalluscoaetaneusS.Y.LiuetS.J.Wei）染色體的數(shù)目及核型分析結(jié)果：染色體數(shù)目2n=26，核型公式為2n=2x=26=20m+6sm，屬“2B”型，將其與魔芋屬其他種類的核型比較，說明桂平魔芋為較原始的物種。目前對(duì)于魔芋染色體帶型的研究?jī)H限于利用Giemsa帶型來探討部分魔芋種的進(jìn)化。而因魔芋種類較多，基因組較大，且細(xì)胞多含多聚糖而粘性過大導(dǎo)致其細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的難度性，對(duì)于魔芋的基因組含量值大小，一直鮮少有報(bào)道。基因組含量值作為物種基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，其大量、快速、準(zhǔn)確的確定有利于魔芋后續(xù)基因組學(xué)方向的研究。

流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種高精度檢測(cè)技術(shù)，起初主要用于醫(yī)學(xué)和動(dòng)物學(xué)，包括細(xì)胞凋亡、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和血液學(xué)等的研究。20世紀(jì)80年代，Galbraith等首次將流式細(xì)胞術(shù)用于植物細(xì)胞周期檢測(cè)和細(xì)胞核DNA含量測(cè)定，開辟了流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于植物研究的先河。由于該技術(shù)在植物研究中具有多功能、高精度、大通量等特點(diǎn)，目前已在多種植物體上得到實(shí)現(xiàn)。流式細(xì)胞術(shù)作為一種快速測(cè)定基因組含量值的方法具有高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種魔芋基因組值的快速測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、易行，對(duì)于基因組含量值的測(cè)量準(zhǔn)確可信，適用于多品種大數(shù)量的魔芋的基因組含量值測(cè)定、比較分析。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種魔芋細(xì)胞核提取液，每1.5mL的配制如下：取5.55mgKCL，3.69mgMgSO₄，1.8mg4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes），36.3μL10%TritonX-100，0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用蒸餾水溶解至1.5mL。

所述的魔芋細(xì)胞核提取液在基因組含量測(cè)定中的應(yīng)用。

一種魔芋基因組含量值的快速測(cè)定方法，包括如下步驟：

（1）取魔芋幼嫩葉片，玉米白化幼嫩葉片為內(nèi)參。

（2）將魔芋、玉米的幼嫩葉片混合剪碎后加到上述魔芋細(xì)胞核提取液中，用刀片垂直切碎后過濾除去懸浮物。

（3）過濾后的細(xì)胞懸液離心后棄上清液。

（4）離心后的沉淀用MgSO₄緩沖液重懸。每445μLMgSO₄緩沖液的配制為：取5.55mgKCL，3.69mgMgSO₄，1.8mgHepes，用蒸餾水溶解至445μL。

（5）往細(xì)胞重懸液中加入核糖核酸酶（RNAse）和碘化丙啶（PI）染料，混勻后避光染色。

（6）染色后的細(xì)胞懸液于流式細(xì)胞儀下測(cè)定。

優(yōu)選的，所述的魔芋基因組含量值的快速測(cè)定方法，包括如下步驟：

（1）取魔芋幼嫩葉片約0.5g，玉米白化幼嫩葉片0.2g作為內(nèi)參。