[發明專利]肉芝軟珊瑚提取物的生物活性MTT測定方法

在審

• 申請號: 201510959582.0
• 申請日: 2015-12-21
• 公開（公告）號: CN106896073A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 褚方強
• 申請（專利權）人: 青島清泉生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于海洋生物醫藥技術領域，具體涉及一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性測定方法。

背景技術

肉芝軟珊瑚(Sarcophyton sp.)，分類學上屬腔腸動物門(Cnidaria)，珊瑚蟲綱(Anthozoa)，軟珊瑚目動物(Alcyonacea)，軟珊瑚科(Alcyoniidae)，肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)動物，是一種在熱帶與亞熱帶比較常見的海洋生物。肉芝軟珊瑚顏色多種，包括褐色、綠色或棕色，帶有白色或金色的水螅體，隨著生長會長出褶皺。珊瑚體呈平鋪的盆形，群體肥厚，中央凹入，表面常具有略呈輻射狀的脊，脊寬約1至3公分；群體的柱部低矮、粗大。

全球有肉芝軟珊瑚約41種，到目前為止，國內外研究者已對該屬的17個種開展了化學成分研究。該屬的化學成分主要有萜類(包括倍半萜、二萜、三萜、四萜，尤其以西松烷二萜居多)、甾醇(尤其以多羥基甾醇居多)、糖苷類、前列腺素、神經酰胺、吡啶衍生物及脂肪酸等化合物。這其中不乏許多結構新穎、生理活性顯著的化學成分，因此我們選擇南海肉芝軟珊瑚(Sarcophyton sp.)進行化學成分及其生物活性的研究。

發明內容

本發明旨在為肉芝軟珊瑚的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。

一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性MTT測定方法，包括如下步驟：

(1)取對數期腫瘤細胞，調整細胞懸液的濃度為200000個/mL，每孔200μL，加入96孔細胞培養板中；

(2)在培養箱中培養4h(37oC，5%CO₂)；

(3)待測樣品分別設5個濃度梯度(每個濃度3個平行樣)，同時設陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μL，培養72h；

(4)每孔加入MTT液10μL，繼續培養4h；

(5)終止培養，離心8min(37oC、2000r/min)，吸去孔內培養液；

(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結晶充分溶解；

(7)酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD_空白對照-OD_樣品)/OD_空白對照×100%計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR%)。

測定原理為：MTT為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，其檢測原理為在活細胞線粒體中，琥珀酸脫氫酶可以使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。Formazan 與活細胞數成正比，二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。以此原理來測定化合物的抗腫瘤活性。

本發明的測定方法相對于現有技術簡單快速、而且檢測結果可靠，適于推廣應用。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

選擇K562和HL-60腫瘤細胞株對從肉芝軟珊瑚分離得到的多羥基甾醇SAR 1 - SAR 11進行體外抗腫瘤活性篩選，包括如下步驟：

(1)取對數期腫瘤細胞，調整細胞懸液的濃度為200000個/mL，每孔200μL，加入96孔細胞培養板中；

(2)在培養箱中培養4h(37oC，5%CO₂)；

(3)待測樣品分別設5個濃度梯度(每個濃度3個平行樣)，同時設陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μL，培養72h；

(4)每孔加入MTT液10μL，繼續培養4h；

(5)終止培養，離心8min(37oC、2000r/min)，吸去孔內培養液；

(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結晶充分溶解；

(7)酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD_空白對照-OD_樣品)/OD_空白對照×100%計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR%)。