[發明專利]地中海貽貝的雌核發育誘導方法

在審

• 申請號: 201510959564.2
• 申請日: 2015-12-21
• 公開（公告）號: CN106906204A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 褚方強
• 申請（專利權）人: 青島清泉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N5/075;A01K61/54
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種地中海貽貝的雌核發育誘導方法。

背景技術

人工誘導雌核發育有利于快速建立純系，因此對于遺傳育種及基礎生物學的研究具有重要意義。在海產經濟貝類方面，該領域的研究相對滯后，目前僅在近十種海洋經濟貝類中進行了人工誘導雌核發育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學方法滅活精子，從而誘導卵子的雌核發育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾，所以近年來有學者嘗試采用異源精子誘導來消除這種干擾，如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而，異源精子誘導依賴于物種的特異性，且受多種環境因素的影響，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激動也往往不同步，而且如果滅活不充分的話，其實仍有精子污染的問題，因此限制了其在雌核發育中的應用。

與傳統的同源或異源精子誘導法相比，電刺激誘導法在整個過程中不需要精子的參與，能徹底排除外源精子基因組的干擾，是理想的誘導方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動物中被廣泛應用并取得了很大的成功。其機制是采用電刺激的方式，使卵母細胞膜上形成可逆微孔，緩沖液中的鈣離子順細胞內外的濃度梯度而進入卵胞質，引發鈣庫釋放鈣離子或者胞質鈣離子的迅速轉移，從而模擬正常受精時鈣離子規律性的波動現象啟動卵子發育。但迄今為止，該方法在海洋生物雌核發育研究中，尚無報道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導地中海貽貝雌核發育，對其誘導參數及雌核發育過程中的細胞學機制進行初步探索，旨在建立電刺激誘導地中海貽貝雌核發育的技術方法。

發明內容

針對上述問題，本發明旨在建立電刺激誘導地中海貽貝雌核發育的技術方法。

一種地中海貽貝的雌核發育誘導方法，采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調好電脈沖儀參數，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理；

所述電刺激緩沖液為山梨醇緩沖液，具體成分為：含有0.25 mmol/L Mg(C₂H₃O₂)₂·4H₂O，0.5 mol/L Hepes，0.1 mmol/L Ca(C₂H₃O₂)₂H₂O，1% BSA，0.25 mmol/L山梨醇；

所述電脈沖儀參數為場強1.25 kv/cm，電容4μF，2次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為6×10⁴個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養方法為：經電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養，水溫保持 20℃，培養密度為每個培養皿中每升約 2×10⁵個卵子；培養初期每半小時輕輕攪動海水一次，以后每3~4h 攪動一次，以促進其孵化。

電刺激處理后 2 小時統計各組的卵裂率，24 小時統計胚胎存活率；

卵裂率或雌核發育誘導率=發生卵裂和排放極體的卵數/觀察總卵數×100%；

胚胎存活率=上浮的原腸胚數量/發生卵裂的總卵數×100%。

本發明的方法簡單有效，經電刺激誘導后，地中海貽貝的卵裂率可達到28%以上，胚胎存活率可達到98%以上。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

親本的暫養與精卵的收集

地中海貽貝取回后洗刷干凈，暫養于14℃循環海水中，雌雄個體分開暫養。投喂餌料。暫養期間每天升溫1℃，至16~17℃恒溫待產。采用陰干升溫法催產獲得卵子，具體操作如下：挑選性腺飽滿的成熟雌貝，洗刷干凈后陰干 50min，然后將其放入水桶中，在 20℃海水中催產。待卵子產出后，先用 300 目篩絹過濾卵子，然后用 500 目的篩絹過濾收集卵子，稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據實驗需要調整卵子的密度。采用同樣的方法催產雄貝，獲得精子，精卵受精時，調節好精卵的比例。

地中海貽貝卵子的電刺激處理

卵子雌核發育的誘導：采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調好電脈沖儀參數，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理。