[發明專利]一種重組桿狀病毒表面展示系統及回收可溶性蛋白的方法

在審

• 申請號: 201510957313.0
• 申請日: 2015-12-17
• 公開（公告）號: CN105368798A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;黃科;劉瑾;易汪雪;馬峰
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/866;C12N5/10;C12P21/02;C07K1/14
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 房德權

1.一種重組桿狀病毒表面展示系統，所述展示系統除含有表達載體外，其特征在于，還包括特定基因片段，所述特定基因片段包括：GP64信號肽、缺失信號肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白標簽、酶切位點以及終止密碼子。

2.根據權利要求1所述的重組桿狀病毒表面展示系統，其特征在于：所述缺失信號肽的目的可溶性蛋白cDNA基因片段位于GP64信號肽與蛋白標簽之間。

3.根據權利要求1所述的重組桿狀病毒表面展示系統，其特征在于：所述表達載體為pFastBac1vector。

4.根據權利要求1所述的重組桿狀病毒表面展示系統，其特征在于：所述蛋白標簽為MyC、His、GST或HA，優選為His標簽。

5.根據權利要求1所述的重組桿狀病毒表面展示系統，其特征在于：所述終止密碼子為TGA，TAA或TAG，優選為TAG。

6.利用權利要求1-5任一項所述重組桿狀病毒表面展示系統回收可溶性蛋白的方法，其特征在于：

1)構建表達載體及轉化大腸桿菌：首先通過基因擴增方法得到含有目的可溶性蛋白核酸序列的基因片段，將得到的基因片段插入到表達載體中，然后轉化大腸桿菌，酶切位點選用凝血酶的切割位點；基因片段插入表達載體的步驟包括：首先對表達載體進行消化處理，然后在連接酶的作用下將表達載體與核酸序列進行連接，形成完整的環狀質粒，最后將環狀質粒轉化到大腸桿菌DH5α中；

2)表達載體驗證：在得到大腸桿菌Amp抗性轉化株后，挑取部分轉化株，在含有Amp濃度為80-120μg/mL的LB液體培養基中過夜培養，抽提質粒，使用酶切消化處理質粒DNA；通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質粒是否插入正確的位點，同時用PCR方法對陽性轉化株進行分析，最后，將找到的陽性重組子進行測序，驗證轉化質粒的正確性；

3)表達目的可溶性蛋白用重組桿狀病毒粒子克隆的制備：提取陽性重組子的質粒DNA，并將其轉化進入大腸桿菌DH10BacTMEcoli，轉變為桿粒；利用藍/白斑法篩選出含有重組桿粒的克隆，在LB培養基中培養含有重組桿粒的大腸桿菌，抽提重組桿粒，凍干保存，備用；

4)昆蟲細胞的轉染和重組桿狀病毒粒子的收集：①sf9細胞計數，取12.5cm²新細胞培養瓶，每瓶加入9×10⁵個細胞，并以全培培養12-24h，使細胞貼壁；②溶解2μg步驟3)得到的純化重組桿狀病毒質粒于100μL無添加成分的Grace’s培養基中；③將轉染試劑充分搖勻后，取10μL加入100μL無添加成分的Grace’s培養基中，混勻；④將②和③所得溶液混勻，室溫孵育30min，同時以2mL含10％FBS的Grace’s培養基洗滌待轉化的細胞并棄去洗滌液；⑤取0.8mL無添加成分的Grace’s培養基加入④所得質粒于轉染劑的混合液中，輕輕混勻，總體積約1mL，加入④步洗滌完成的待轉化的細胞中，27℃繼續培養5h；⑥移除質粒、轉染試劑混合物，加入2mL含10％FBS的Grace’s培養基，27℃孵育，直至病變現象產生；⑦5天后，1000rpm離心10min收集細胞培養液中的重組桿狀病毒粒子，轉移上清到凍干管中，貼上標簽，置于4℃冰箱中避光保存。

5)重組桿狀病毒粒子的擴增以及目的可溶性蛋白的表達：①取適當體積的重組桿狀病毒粒子原液加入到匯聚度90％的新鮮傳代的sf9細胞中，27℃恒溫培養箱中，靜置1h，每隔15min輕輕晃動一次；②去掉培養瓶中的培養液，加入新鮮的含10％FBS的Grace’s培養基，27℃恒溫培養箱中恒溫培養；③3天后，1000rpm離心10min收集細胞培養液中的病毒粒子，轉移上清液到凍干管中，貼上標簽，置于4℃冰箱中避光存放；④得到的重組病毒粒子重復上述①-③步驟，以獲得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的重組桿狀病毒粒子到匯聚度達95％的新鮮傳代的sf9細胞中，27℃恒溫培養箱中，靜置1h，每隔15min輕輕晃動一次；⑥去掉培養瓶中的培養液，加入新鮮的含10％FBS的Grace’s培養基，27℃恒溫培養箱中恒溫培養；⑦40-44h后，輕輕倒盡細胞上清培養液，加入預冷的細胞裂解液，冰上靜置30min；⑧收集細胞裂解液，加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液上樣緩沖液，混勻，100℃保持10min；⑨SDS-PAGE檢測蛋白質的表達情況；

6)目的蛋白的回收：目的可溶性蛋白展示完成后，將上述步驟5)得到的重組桿狀病毒粒子溶液于18000-22000rpm，4℃離心15分鐘，收集沉淀，既得表面展示有目的可溶性蛋白的重組桿狀病毒粒子，后用少量的純水重懸重組桿狀病毒粒子得重組桿狀病毒粒子溶液，用終濃度為500-1000單位/L的凝血酶切割重組桿狀病毒粒子表面的可溶性蛋白，使帶有特定標簽的目的可溶性蛋白與桿狀病毒分離，然后用帶有特定標簽的分離柱對目的蛋白進行回收純化，最后得到高純度的目的蛋白。