[發(fā)明專利]一種重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)及回收可溶性蛋白的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510957313.0
• 申請日: 2015-12-17
• 公開（公告）號: CN105368798A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈鶴霄;黃科;劉瑾;易汪雪;馬峰
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/866;C12N5/10;C12P21/02;C07K1/14
• 代理公司: 北京華沛德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 房德權(quán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用桿狀病毒表面展示系統(tǒng)展示可溶性蛋白以及從桿狀病毒表面回收可溶性蛋白的方法。

背景技術(shù)

桿狀病毒是節(jié)肢動物門的專性寄生病毒，自20世紀(jì)80年代被開發(fā)為表達(dá)載體依賴，由于其真核表達(dá)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的重視和研究，在短短不到30年的時間里，桿狀病毒表達(dá)體系的重組載體構(gòu)建技術(shù)、篩選技術(shù)得到了很大程度的改進(jìn)和簡化，成為與大腸桿菌、酵母、哺乳動物相并列的四大表達(dá)載體系之一。在表面展示、類病毒顆粒表達(dá)、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移、RNA干擾等方面取得了重要的成果。

桿狀病毒基因組為130kb左右，因此可以容納較大的外源DNA片段。病毒基因組中多角體蛋白基因是病毒感染晚期高效表達(dá)的基因，卻是病毒復(fù)制增殖的非必需區(qū)，因此適用于插入外源基因的多拷貝。該基因受強(qiáng)啟動子調(diào)控，可較高水平表達(dá)外源蛋白。外源DNA插入多角體蛋白基因內(nèi)，使此基因功能喪失，不能再合成多角體蛋白。另外，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。

桿狀病毒表面展示系統(tǒng)在經(jīng)過不斷地研究與改進(jìn)后，表現(xiàn)出了極為廣闊的應(yīng)用前景，該系統(tǒng)屬于高等真核生物展示系統(tǒng)，可彌補(bǔ)原核展示系統(tǒng)的不足，并保持表面展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，在高親和力抗體及多肽藥物的篩選、蛋白質(zhì)抗原表位分析、構(gòu)建多肽文庫和抗體庫、新型疫苗研制、基因治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

雖然目前桿狀病毒表面展示系統(tǒng)已經(jīng)研究的很成熟了，但是目前商業(yè)化的桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)量較低，且表達(dá)的蛋白難以分離純化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是為了克服以上的技術(shù)缺陷提供一種可溶性蛋白桿狀病毒表面展示系統(tǒng)。

本發(fā)明的目的之二是為了提供一種對上述桿狀病毒表面展示的可溶性蛋白進(jìn)行回收的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)，所述展示系統(tǒng)除含有表達(dá)載體外，其特征在于，還包括特定基因片段，所述特定基因片段包括：GP64信號肽、缺失信號肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)以及終止密碼子。

進(jìn)一步地，所述缺失信號肽的目的可溶性蛋白cDNA基因片段位于GP64信號肽與蛋白標(biāo)簽之間。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為pFastBac1vector。

進(jìn)一步地，所述蛋白標(biāo)簽為MyC、His、GST或HA，優(yōu)選為His標(biāo)簽。

進(jìn)一步地，所述終止密碼子為TGA，TAA或TAG，優(yōu)選為TAG。

利用上述重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)回收可溶性蛋白的方法，

1)構(gòu)建表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化大腸桿菌：首先通過基因擴(kuò)增方法得到含有目的可溶性蛋白核酸序列的基因片段，將得到的基因片段插入到表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切位點(diǎn)選用凝血酶的切割位點(diǎn)；基因片段插入表達(dá)載體的步驟包括：首先對表達(dá)載體進(jìn)行消化處理，然后在連接酶的作用下將表達(dá)載體與核酸序列進(jìn)行連接，形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒，最后將環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中；

2)表達(dá)載體驗證：在得到大腸桿菌Amp抗性轉(zhuǎn)化株后，挑取部分轉(zhuǎn)化株，在含有Amp濃度為80-120μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，使用酶切消化處理質(zhì)粒DNA；通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒是否插入正確的位點(diǎn)，同時用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析，最后，將找到的陽性重組子進(jìn)行測序，驗證轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的正確性；

3)表達(dá)目的可溶性蛋白用重組桿狀病毒粒子克隆的制備：提取陽性重組子的質(zhì)粒DNA，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH10BacTMEcoli，轉(zhuǎn)變?yōu)闂U粒；利用藍(lán)/白斑法篩選出含有重組桿粒的克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有重組桿粒的大腸桿菌，抽提重組桿粒，凍干保存，備用；