[發明專利]一種可提高肝細胞體外分化表型及功能的培養方法

有效

• 申請號: 201510937399.0
• 申請日: 2015-12-15
• 公開（公告）號: CN105695392B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 王秀麗;魏國峰;徐紅
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 高學剛

本發明公開一種可提高肝細胞體外分化表型及功能的培養方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：采用肝細胞為種子細胞，以多孔蠶絲蛋白支架作為肝細胞體外培養載體，將肝細胞、肝源性間質細胞和細胞外基質按一定比例接種到多孔蠶絲蛋白支架上，并將多孔蠶絲蛋白支架置于模擬肝細胞的體外培養微環境中進行培養；該方法所建立的三維肝細胞共培養體系，不但可以用于組織工程化肝細胞功能單元，而且還可用于體外評價藥物對肝代謝酶的影響及肝毒性檢測，為新藥研發提供新的篩選評價工具。

技術領域

本發明涉及一種肝細胞的體外培養方法，特別是一種可提高肝細胞體外分化表型及功能的培養方法。

背景技術

原代肝細胞不但是構建組織工程化肝臟的理想種子細胞來源，而且也是對藥物體外ADME/T性質進行準確評價的重要模型。但肝細胞在傳統的體外平面培養過程中極易出現“去分化”，即出現活性的降低，表型的改變以及功能活性（包括合成和代謝活性）的降低甚至完全喪失。研究證實：新鮮分離的人肝細胞在懸浮培養條件下，其P450酶活性僅維持4h；在膠原包被的培養板內，貼壁細胞的P450酶表達量及酶活性在24－48h后便會顯著降低。而由于酶功能活性的降低，肝細胞單層培養法在肝毒性藥物篩選中的靈敏度僅有50％。因此如何在體外培養中克服或延緩肝細胞的“去分化”現象，從而有效維持肝細胞的理想分化狀態，即維持其表型及相關功能一直是肝細胞培養及應用研究中所亟待解決的“瓶頸”問題。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種能夠理想維持肝細胞生長活性，并顯著提高體外培養肝細胞表型及功能活性的新培養方法。

本發明的技術解決方案是：一種可提高肝細胞體外分化表型及功能的培養方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：采用肝細胞為種子細胞，以多孔蠶絲蛋白支架作為肝細胞體外培養載體，將肝細胞、肝源性間質細胞和細胞外基質按一定比例接種到多孔蠶絲蛋白支架上，并將多孔蠶絲蛋白支架置于模擬肝細胞的體外培養微環境中進行培養，

所述的將肝細胞、肝源性間質細胞和細胞外基質按一定比例接種到多孔蠶絲蛋白支架上的具體操作步驟如下：將新鮮分離的肝細胞和肝星形間質細胞按照細胞數3:1的比例混合，并將獲得的混合細胞與細胞外基質混合，獲得細胞-基質混合物，所述的細胞外基質由膠原和基質膠按照體積比為1:1的比例混合而成，然后將細胞-基質混合物多點接種至多個多孔蠶絲蛋白支架，并保證肝細胞數量為600,000cells/支架，基質膠的體積為30μL/支架，

所述的將多孔蠶絲蛋白支架置于模擬肝細胞的體外培養微環境中進行培養的具體操作步驟如下：將接種完成的多孔蠶絲蛋白支架按照1個支架/孔的密度放置到多孔細胞培養板中，并將多孔細胞培養板置于細胞培養箱中，在37℃、5%CO₂的條件下凝膠化2h，然后向多孔細胞培養板的每個孔中加入共培養基，所述的共培養基為肝細胞培養基和星形間質細胞培養基按照體積比為1:1的比例混合而成。

本發明同現有技術相比，具有如下優點：