[發(fā)明專利]一種可提高肝細(xì)胞體外分化表型及功能的培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510937399.0
• 申請日: 2015-12-15
• 公開（公告）號: CN105695392B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王秀麗;魏國峰;徐紅
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 高學(xué)剛

1.一種可提高肝細(xì)胞體外分化表型及功能的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進(jìn)行：采用肝細(xì)胞為種子細(xì)胞，以多孔蠶絲蛋白支架作為肝細(xì)胞體外培養(yǎng)載體，將肝細(xì)胞、肝源性間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)按一定比例接種到多孔蠶絲蛋白支架上，并將多孔蠶絲蛋白支架置于模擬肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)微環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，

所述的將肝細(xì)胞、肝源性間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)按一定比例接種到多孔蠶絲蛋白支架上的具體操作步驟如下：將新鮮分離的肝細(xì)胞和肝星形間質(zhì)細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)3:1的比例混合，并將獲得的混合細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)混合，獲得細(xì)胞-基質(zhì)混合物，所述的細(xì)胞外基質(zhì)由膠原和基質(zhì)膠按照體積比為1:1的比例混合而成，然后將細(xì)胞-基質(zhì)混合物多點(diǎn)接種至多個(gè)多孔蠶絲蛋白支架，并保證肝細(xì)胞數(shù)量為600,000cells/支架，基質(zhì)膠的體積為30μL/支架，

所述的將多孔蠶絲蛋白支架置于模擬肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)微環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)的具體操作步驟如下：將接種完成的多孔蠶絲蛋白支架按照1個(gè)支架/孔的密度放置到多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并將多孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO₂的條件下凝膠化2h，然后向多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入共培養(yǎng)基，所述的共培養(yǎng)基為肝細(xì)胞培養(yǎng)基和星形間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基按照體積比為1:1的比例混合而成，

所述的多孔蠶絲蛋白支架按照如下步驟制備：首先制備濃度為6-7%的絲素蛋白溶液，采用鹽析-干燥法制備多孔絲素蛋白支架，通過鹽顆粒大小控制支架孔徑為500-600 μm,干燥后充分浸潤于去離子水內(nèi)，然后采用標(biāo)準(zhǔn)打孔器制備直徑5mm，厚度3mm的三維支架，即多孔蠶絲蛋白支架，并且多孔蠶絲蛋白支架在接種細(xì)胞前需經(jīng)高溫高壓滅菌處理，且浸泡在培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行預(yù)平衡12 h。