[發明專利]YBX1穩定表達的SMCC-7721細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 201510937340.1
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN106867968A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉秀梅;夏天
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體地說涉及一種人YBX1蛋白穩定表達的SMCC-7721細胞系及其構建方法。

背景技術

Y-box結合蛋白(Y-box binding protein)是一類特異性結合目的基因啟動子和增強子內部Y-box序列(CTGATTGGCCAA)的轉錄因子，廣泛存在于從細菌到人類的許多物種中。YBX1是Y-box結合蛋白家族的成員之一，分子量為35kD，該基因定位于染色體上1p34。YBX1蛋白從結構上分為三部分：N端結構域、冷激結構域(Cold Shock Domain，CSD)和C端結構域。其中N端結構域的序列在不同物種間變化較大，而CSD中氨基酸殘基序列表現出高度的進化保守性，并直接參與識別和結合DNA Y-box序列的過程，C端結構域的序列則具有酸性和堿性氨基酸殘基富集區交替出現的特點。近些年的研究表明，YBX1與腫瘤的發生和維持存在廣泛密切的聯系，發揮多種重要的生理功能。

研究發現，YBX1不僅可以與DNA結合，還可以與mRNA相互作用形成復合體，或抑制其編碼蛋白的翻譯，或維持mRNA穩定性，或參與mRNA的選擇性剪切。YBX1與人類惡性腫瘤關系非常密切，在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中發現YBX1異常表達，并與惡性腫瘤的發生、發展呈高度相關性。研究表明，過度表達的YBX1可以通過調控細胞周期蛋白cyclinA和cyclinB來促進腫瘤細胞增殖，而抑制YBX1活性能有效地抑制腫瘤生長。Lasham等研究證實，YBX1通過下調凋亡蛋白表達量或提高抗凋亡蛋白的表達而導致細胞凋亡通路功能異常，致使癌細胞擁有更強的存活力。此外，還有研究發現，YBX1可以作為轉錄因子參與腫瘤擴散和轉移過程，以及誘導腫瘤細胞產生耐藥性等生物學功能，但其作用機制尚不清楚。2015年，El Naggar等在《Cancer Cell》報道，YBX1通過直接與HIF1A轉錄區域結合來上調HIF1а蛋白表達，從而促進肉瘤轉移。

肝癌在我國的發病率和死亡率很高，嚴重危害國民的身體健康。對肝癌發病機制的研究是腫瘤生物學研究的重要課題。目前關于YBX1功能研究主要發生在乳腺癌的增殖、遷移和表皮細胞間質化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT)等方面，而對YBX1蛋白在肝癌發生發展過程中的生物學調控機制報道很少，尤其是YBX1對肝癌能量代謝途徑的調控機制尚不清楚。本發明通過慢病毒轉染方法獲得YBX1穩定表達的SMCC-7721肝癌細胞株，為研究YBX1在肝癌中的調控機制提供有力的實驗工具。

發明內容

本發明的目的是提供一種穩定表達人YBX1蛋白的SMCC-7721細胞系及其構建方法，該細胞株可用于研究YBX1在肝癌細胞中的作用機制與腫瘤能量代謝提供有力工具。

本發明提供的一種穩定表達人YBX1蛋白的SMCC-7721穩定細胞系，是以肝癌細胞系SMCC-7721細胞作為宿主細胞，感染表達YBX1基因的慢病毒培養液，經過Puromycin藥物篩選陽性細胞、細胞增殖后獲得高效表達YBX1蛋白的穩定細胞系。與對照細胞相比，該陽性細胞系YBX1基因和蛋白表達量顯著提高。通過tGFP融合基因表達的綠色熒光蛋白可以指示YBX1的細胞定位和表達水平。

本發明提供的一種穩定表達人YBX1蛋白的SMCC-7721細胞系的構建方法，其慢病毒表達載體pGIPZ-YBX1-tGFP構建方法，包括如下步驟：

(1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶鏈式反應(PCR)技術，以人正常乳腺癌細胞(HMLE)cDNA為模板擴增YBX1全長基因序列。PCR引物序列為：

YBX1Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)將擴增的人YBX1全長基因序列克隆到T載體中，構建成T-YBX1重組載體。

(3)利用多重PCR方法，分別以T-YBX1載體為模板擴增YBX1基因，以pGIPZ載體為模板擴增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下(括號中表示酶切位點或接頭序列，下劃線表示基因名稱)：

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'