[發明專利]YBX1穩定表達的SMCC-7721細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 201510937340.1
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN106867968A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉秀梅;夏天
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

1.一種穩定表達YBX1蛋白的SMCC-7721細胞系的構建方法，其特征在于，以肝癌SMCC-7721細胞作為宿主細胞，感染帶有YBX1基因的慢病毒表達質粒，經Puromycin藥物篩選、細胞擴大培養后獲得。

2.如權利要求1所述的穩定表達YBX1蛋白的SMCC-7721細胞系的構建方法，其特征在于，其中慢病毒表達載體pGIPZ-YBX1-tGFP構建方法在于：

(1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶鏈式反應(PCR)技術，以人正常乳腺癌細胞(HMLE)cDNA為模板擴增YBX1全長基因序列；PCR引物序列為，

YBX1 Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1 Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)將擴增的人YBX1全長基因克隆到T載體中，構建成T-YBX1重組載體；

(3)采用多重PCR方法，分別以T-YBX1載體為模板擴增YBX1基因，以pGIPZ載體為模板擴增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下(括號中表示酶切位點或接頭序列，下劃線表示基因名稱)：

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'CMV：5'-GGTGGCAGATCCTCTAGTAGAG-3'

5'(CMV)-YBX1：

5'-AGAGGATCTGCCACCATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

3'YBX1-(GFP)：

5'-TCCATACCTCCAGCTCCCTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

5'tGFP：5'-GGAGCTGGAGGTATGGAGAGCGACGAGAGCG-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(4)將上述PCR產物純化后、混合在一起作為模板，利用下列引物擴增CMV-YBX1-tGFP融合基因；其中5'端引物帶有Xba I位點，3'端引物帶有Not I位點，

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(5)將上述PCR產物克隆到pCR4-Blunt載體上，包括如下步驟：利用Xba I和Not I雙酶切PCR產物，然后切膠回收；將pCR4-Blunt載體同樣進行Xba I和Not I雙酶切，切膠回收線性載體；將CMV-YBX1-tGFP基因連接到pCR4-Blunt線性載體上，構建pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP重組載體，送測序鑒定；

(6)將上述CMV-YBX1-tGFP基因克隆到慢病毒表達載體pGIPZ上，包括如下步驟：利用Xba I和Not I雙酶切pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP載體，切膠回收CMV-YBX1-tGFP基因，利用Xba I和Not I雙酶切pGIPZ載體，切膠回收線性載體；將上述獲得的CMV-YBX1-tGFP基因連接到pGIPZ線性載體中，最終獲得表達YBX1基因的慢病毒表達載體pGIPZ-YBX1-tGFP。