[發明專利]快速簡易分離純化降纖酶的方法

在審

• 申請號: 201510936687.4
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN105349514A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 池明宇;鄭貴元;金星光;關書博;董志輝;張家策
• 申請（專利權）人: 遼寧省血栓病中西醫結合醫療中心
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 周智博;宋鐵軍

1.一種快速簡易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法上柱之前，用10,000MW膜和50,000MW膜超濾蛇毒溶液，去除絕大部分雜質，再利用肝素-Sepharose4B柱的分離純化進行制備。

2.根據權利要求1所述的快速簡易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法的步驟如下：

（1）、精密稱取白眉蝮蛇毒14-16g，在3℃～5℃條件下，用200ml0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液進行溶解，溶解液在3℃～5℃條件下用12000～13000轉/分離心機離心20分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用；

（2）將離心上清液首先用截留分子量50,000MW的超濾膜進行超濾，將濾液收集起來，然后把此濾液用截留分子量10,000MW的超濾膜再進行超濾，這次收集膜上部分，用0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液定容至50ml；

（3）將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經用0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液充分沖洗平衡的肝素-Sepharose4B柱，上完樣，用0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液充分洗脫，直至基線平直，然后用0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液對含1MNaCL的0.1MTris-HCL,PH7.0±0.2緩沖液進行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰，進行純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。

3.根據權利要求2所述的快速簡易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：

肝素-Sepharose4B柱的制備：

a、取100—110gCNBr-activatedSepharose4B膠用1mMHCL﹙PH2.0～3.0﹚溶液充分膨脹，然后用1mMHCL﹙PH2.0～3.0﹚溶液進行充分洗滌,1g膠要用大于200ml以上的該溶液進行洗滌；

b、精密稱取400—440萬單位肝素，用偶聯緩沖液即含0.5MNaCL的0.1MNaHCO3PH8.3±0.2的緩沖液進行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯緩沖液；

c、將含肝素的偶聯緩沖液倒入用1MmHCL﹙PH2.0～3.0﹚溶液處理過的CNBr-activatedSepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉一個小時；

d、用偶聯緩沖液充分沖洗剛偶聯肝素的膠，至少沖洗膠體積的5倍以上；

e、將剛用偶聯緩沖液充分沖洗過的膠轉移到0.1MTris-HCL,PH8.0±0.2的緩沖液中，室溫放置2小時；

f、將e項剛處理完的膠用含0.5MNaCL的0.1M醋酸/醋酸鈉PH4.0±0.2的緩沖液和含0.5MNaCL的0.1MTris-HCL,PH8.0±0.2的緩沖液進行交替洗滌，交替洗滌次數至少3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱里即可使用。