[發明專利]快速簡易分離純化降纖酶的方法

在審

• 申請號: 201510936687.4
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN105349514A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 池明宇;鄭貴元;金星光;關書博;董志輝;張家策
• 申請（專利權）人: 遼寧省血栓病中西醫結合醫療中心
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 周智博;宋鐵軍

技術領域：本發明涉及快速簡易分離純化降纖酶的方法。

背景技術：降纖酶是特定蛇毒當中提取的一種蛋白酶，它有溶栓、抗栓、降黏、降纖等明確的藥理作用，廣泛應用于各種栓塞性疾病比如腦血栓、短暫性腦缺血發作、心肌梗死、股動脈栓塞、血栓閉塞性脈管炎、肺栓塞等。

我院是治療血栓病的?？漆t院，是血栓病國家重點專科醫院。從上世紀八十年代開始使用蛇毒制劑，是最早使用蛇毒制劑治療血栓病的醫院，可以說我院是從蛇毒制劑開始起家的。蛇毒抗栓制劑從第一代產品蝮蛇抗栓酶到第二代產品精制蝮蛇抗栓酶再到第三代產品降纖酶，經歷了從多組分制劑到單組分制劑，從副作用比較大到幾乎沒有副作用，這樣一個內在質量逐步提升的過程。我們醫院研究所一直從事于蛇毒成分的分離純化及臨床應用研究，積累了比較豐富的經驗和實驗技能，這為以后繼續從事更高層面的蛇毒有效成分的分離純化、臨床應用研究奠定了堅實的基礎。

從包含數百種化合物的蛇毒當中分離純化有效成分—降纖酶確實是一件不容易的工作。由于蛇毒當中的成分太復雜，分離降纖酶的工藝大多操作復雜、步驟多、分離柱子多，所以所需時間往往很長，而又由于步驟多時間長當然損失多、收率也不高、染菌污染的機會就多。下面具體介紹一下這些分離純化降纖酶的方法﹕

管利豐等〔1〕報道的方法為︰將蛇毒粗品200毫克溶于含1×10-2mol/LEDTA,pH8.0的0.005mol/L磷酸鹽緩沖液20ml中，使蛇毒中金屬蛋白水解酶失活。在對含1×10-4mol/LEDTA透析后，將溶液通過EDTA-纖維素﹙DE-52﹚層析，得到3個具精氨酸酯酶活性的峰，即緩激肽釋放，凝結活性和溶血纖原的活性3類成分。其中凝結活性的成分即類凝血酶，約占總精氨酸酯酶活性的60％。將上述具凝結活性成分的凍干品3克溶于含0.1mol/LEDTA,pH7.2的0.005mol/L磷酸鹽緩沖液10ml中，離心。上清液通過SephadexG-25柱并用同種緩沖液洗脫，其第一個峰即類凝血酶，再進一步純化。

將洗脫液再用DE-22柱層析，條件同DE-52柱，收集類凝血酶活性部分，透析并凍干。凍干物100毫克溶于pH8.0的0.005mol/L磷酸鹽緩沖液10毫升中，用DE-52柱層析。將具類凝血酶活性部分再用DE-52柱層析一次。所得活性成分20毫克再通過SephadexG-75柱純化得精品。

管利豐等〔2〕又將上述制備方法進行改進，如下所述。

蛇毒粗品用DEAE-SephadexA-25柱層析，用pH7.8的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液并0～0.1mol/L氯化鈉線性梯度洗脫類凝血酶。收集活性成分對pH5.0的0.01mol/L醋酸鈉緩沖液透析，然后通過SP-SephadexC-25柱層析，在同種緩沖液中以0～0.15mol/L氯化鈉線性梯度洗脫。收集活性成分再通過SephadexG-75柱層析，純化物凍干得精品。

孔維權等〔3〕報道的方法為﹙1﹚取蛇毒粗品16克，用EDTA絡合-硫氰酸鉀沉淀法初步分離類凝血酶，在上層析柱前先將出血毒去除，并去除一部分非類凝血酶成分；﹙2﹚用DEAE-SepharoseFastFlow快速柱層析，pH8.0的0.05mol/LTris-HCL平衡，由﹙1﹚得到的蛇毒溶液透析脫鹽，上述緩沖液平衡，上柱并進行梯度洗脫，洗脫條件混合筒為PH8.0的0.05mol/LTris-HCL2000ml作起始緩沖液，貯存筒為含0.4mol/L氯化鈉的上述起始緩沖液。測定洗脫液在波長280nm處的吸光度A,以A為縱坐標,管數為橫坐標繪制層析圖，測定各峰類凝血酶活性及分子量分布，取與降纖酶性質相同的洗脫組分進行下一步純化；﹙3﹚用Sephadex-75prepgrad柱層析，無熱原蒸餾水平衡，取上述﹙2﹚所得組分，濃縮后上柱，無熱原蒸餾水洗脫，測定洗脫液280處A，繪制層析圖。逐管檢測凝血活性，將具有凝血活性的組分每3管合并，取樣作SDS-PAGE，合并收集單一區帶﹙相對分子質量Mr為36000﹚組分，即為純化的降纖酶。