[發明專利]一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法

有效

• 申請號: 201510926237.7
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105424666B
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 韓利文;張云;何秋霞;韓建;孫晨;侯海榮;王榮春;彭維兵;王雪;陳錫強;楚杰;劉可春
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01B11/28
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 張宏松

本發明涉及一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法，該方法采用血管特異表達綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚，通過直接在斑馬魚培養用水中加入待測藥物，檢測斑馬魚尾靜脈網的相對面積，建立了一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進的方法，以用于藥物篩選。在斑馬魚實驗中，本發明首次將尾靜脈網相對面積作為血管生成作用的評價新指標，分析待測物是否具有促進血管生成作用，更加科學、客觀，提高了結果的準確性。

技術領域

本發明涉及一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法，具體是一種通過檢測血管特異表達綠色熒光的轉基因斑馬魚的尾靜脈網的相對面積來快速評價外源性藥物或環境異物對斑馬魚血管生成的促進作用的方法，屬于藥物篩選領域。

背景技術

血管生成與多種疾病相關。血管生成不僅存在于胚胎發育時期，在整個生命周期均有重要的生理、病理意義。在成人，其涉及腫瘤、炎癥、缺血性疾病、糖尿病視網膜病、創傷愈合等諸多病理過程而成為研究的重點。血管生成是連續、復雜的過程，是細胞-細胞(內皮細胞、周細胞、平滑肌細胞、纖維細胞)之間，細胞和細胞因子之間在不同時空協同作用的結果。

治療性血管生成的概念，最早由Hockel于1993年提出，與傳統的治療手段(血管搭橋)不同，它是利用成血管誘導因子或內皮祖細胞，模擬體內血管生成的機制，達到促血管新生，改善側支循環的目的，即通過刺激和誘導新生血管的形成來治療和預防以局部缺血為特征的臨床各類疾病。實際上就是指以增加新生血管、改善血運為主要措施來治療臨床上缺血性及其相關疾病的方法的總稱。現已經廣泛應用于缺血性及其相關疾病：心臟缺血、肢體缺血、皮瓣愈合、周圍神經損傷、傷口愈合等。

目前研究血管生成的動物模型主要有：大鼠模型、雞胚尿囊膜模型和斑馬魚模型。研究表明，斑馬魚與人類在血管發育過程中的基因、信號通路具有高度同源性，其結構、生理、分子水平等方面與人類都很接近，而且與大鼠、雞胚尿囊膜模型相比，斑馬魚具有成本低、飼養條件要求低、個體小適合于高通量篩選、幼魚身體透明易于觀察血管發育的特點，具有明顯的優勢，因此，采用斑馬魚進行血管生成的研究具有凸顯的優勢。

在斑馬魚評價血管生成促進作用的實驗中，目前使用指標主要是節間血管、腸下靜脈，利用節間血管或腸下靜脈的數量、長度、棘突數量等作為評價依據。但是在實際的實驗過程中各自存在不足之處；1、利用節間血管作為指標的方法中，需要事先加入血管生成抑制劑損傷節間血管，再觀察藥物的促進再生作用。受試藥物的作用體現受制于血管生成抑制劑的作用，受試藥物逆轉的是采用的抑制劑的作用靶點和通路，篩選的范圍受抑制劑選擇的局限。2、以腸下靜脈為指標的方法中，由于腸下靜脈本身為籃球網狀結構，對其拍照非常困難，斑馬魚拍攝時的體位嚴重影響腸下靜脈的成像，進而影響結果的計算和統計。

中國專利文獻CN101179935公開了一種缺血性視網膜組織的血管再生和為此目的的篩選方法，該篩選方法使用小鼠為模型，以潛在治療劑向所述小鼠的眼給藥；使所述小鼠安樂死并從給予所述推定治療劑的所述眼中取出基本上整個視網膜；對給予了所述推定治療劑的所述眼的所述視網膜血管系統進行染色并制備顯微圖像，圖像顯示所述染色視網膜中血管閉塞面積和視網膜前新生血管叢面積；同時做對照試驗，并將所述染色視網膜中的視網膜前新血管叢面積與小鼠對照眼的染色視網膜中可觀察到的視網膜前血管叢面積進行比較，該方法受試藥物的作用體現受制于血管生成抑制劑的作用，受試藥物逆轉的是采用的抑制劑的作用靶點和通路，篩選的范圍受抑制劑選擇的局限，且步驟繁瑣。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法，該方法采用血管特異表達綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚，通過直接在斑馬魚培養用水中加入待測藥物，檢測斑馬魚尾靜脈網的相對面積，成功地建立了一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進的方法，具有操作簡單、快速、穩定可靠和重復性好的優點。

術語說明：