[發(fā)明專利]一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510925072.1
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105463086A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程樂華;鄧小凈;盧守建;樂亞玲;梁超;王緒華;方國偉;陳忠;黃士昂
• 申請（專利權(quán)）人: 上海新培晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

Dubin-Johnson綜合征(DJS)是一種少見的以慢性持續(xù)性或間歇性黃疸為臨床特點(diǎn)的常染色體隱性遺傳病，以結(jié)合膽紅素增高為主的先天性非溶血性黃疸。由Dubin和Johnson于1954年首先報(bào)道，常見于青少年和幼年。復(fù)合耐藥相關(guān)蛋白2MRP2(編碼基因ABCC2)，是ATP依賴的有機(jī)陰離子的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，如二葡萄糖苷酸膽紅素、硫酸鹽、還原型谷胱甘肽等的轉(zhuǎn)運(yùn)，是非膽汁酸鹽依賴性膽汁流形成的重要因素。由于毛細(xì)膽管上位于10q24的多特異性有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cMOAT)的基因(ABCC2/MRP2超家族)缺陷，導(dǎo)致毛細(xì)膽管對有機(jī)陰離子尤其是兩性化合物如二葡萄糖苷酸膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)異常，肝細(xì)胞先天性膽紅素排泌障礙，對非水溶性有機(jī)陰離子的排泄也有缺陷，但對膽鹽的排泌正常，導(dǎo)致DJS。

本病較罕見，以多見于男性。Dubin-Johnson4000例肝臟活體組織檢查中有12例(0.3％)，美國肝病登記8000例有23例(0.29％)，國內(nèi)也有本病的報(bào)導(dǎo)，發(fā)病率亦不高。本綜合征的臨床表現(xiàn)大致有三種類型:第一種是臨床無任何自覺癥狀，常因其它疾病就診而被發(fā)現(xiàn)，此類少見。第二種是長期黃疸反復(fù)發(fā)作，食欲不振、疲乏無力，肝區(qū)不適，惡心甚至嘔吐，尿色加深，酷似病毒性肝炎。此類最常見。第三種是持續(xù)黃疸不退，尿色深黃，但胃腸癥狀不明顯，可應(yīng)付日常工作。DJS常見于青少年，因?yàn)樵摷膊“Y狀輕微，醫(yī)生或患者對該疾病認(rèn)識不足不予重視，導(dǎo)致患者長期誤診。

ABCC2基因位于染色體10q24，為45kb，包括32個外顯子，不同的種族存在不同的MRP2/ABCC2基因突變類型。ABCC2基因在1066密碼子突變，使4個跨膜區(qū)和整個第2個三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)缺失，從而喪失轉(zhuǎn)運(yùn)非膽汁酸有機(jī)陰離子的功能。最新報(bào)道表明ABCC2基因第17號外顯子錯義突變和第28外顯子無義突變共同引起雜合性突變，也可導(dǎo)致MRP2蛋白功能喪失，使二葡萄糖苷酸膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而引起DJS。

明確診斷可以避免反復(fù)就診和不必要的治療，以及避免其加重?fù)p害的因素。通過對ABCC2基因的檢測，尤其是編碼MRP2段基因的檢測有助于診斷DJS，減少誤診的發(fā)生。Sanger測序法是目前公認(rèn)的，是大多數(shù)臨床分子診斷項(xiàng)目的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性甚至能達(dá)到100％，是分子診斷方面的經(jīng)典技術(shù)平臺。因此采用Sanger測序法對編碼MRP2的基因ABCC2的序列進(jìn)行突變檢測，具有穩(wěn)定性高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效避免假陽性的產(chǎn)生。

為了給Sanger測序提供可靠的模板，首先必須針對該項(xiàng)目的特點(diǎn)，建立一個穩(wěn)定可靠的PCR體系。該項(xiàng)目PCR部分在技術(shù)環(huán)節(jié)存在以下兩個難點(diǎn)：1.該項(xiàng)目需要提取血液全基因組DNA，由于臨床標(biāo)本物流運(yùn)輸中存在眾多不可控因素，因此臨床檢驗(yàn)中往往得不到質(zhì)量優(yōu)良的全血標(biāo)本，因此獲得的DNA質(zhì)量也會存在較大的樣本間差異。2.由于需檢測的外顯子數(shù)目較多，即PCR目的片段過多，導(dǎo)致PCR條件不統(tǒng)一。

溶解溫度(Tm)是PCR中一個很重要的參數(shù)，是50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度，對于設(shè)定PCR退火溫度是必須的，合適的退火溫度能夠有效的減少非特異性結(jié)合，還能保證目的序列有效退火。所以在保證特異性的情況下，設(shè)計(jì)引物的Tm值盡量接近，使PCR的退火溫度可以保持一致，從而達(dá)到PCR條件的統(tǒng)一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒可用于檢測ABCC2基因的突變位點(diǎn)，特異性好，靈敏度高。

本發(fā)明的一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒，所述試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑以及用于樣本DNA中ABCC2基因擴(kuò)增的PCR引物；其中，PCR引物如下：

ABCC2-3F：CCTATCCATCACCGGAAACC；

ABCC2-3R：TGTTTCACCCCATTCCAACC；

ABCC2-7F：TATCGACAAGATCGCAACTCC；

ABCC2-7R：ATCTTCCGCTGGCAATCA；

ABCC2-8F：TGGAACAGTGAAGGCAGC；

ABCC2-8R：CATCTTGAAAACTGCCTGC；

ABCC2-9F：GCTAGATGCGATGGCGTATG；