[發(fā)明專利]一種用于蛋白標(biāo)記及檢測(cè)的熒光探針及其合成方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510923072.8
• 申請(qǐng)日: 2015-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN106867515B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐兆超;喬慶龍;苗露
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C07D221/14
• 分類號(hào): C07D221/14;C09K11/06;C07D473/18;G01N21/64;C07K1/13
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明提供了一種用于蛋白標(biāo)記及檢測(cè)的熒光探針及其合成方法與應(yīng)用。本探針通過4?溴?1,8?萘酐與疊氮化鈉、九水硫化鈉、乙酰氯、二乙胺等反應(yīng)得到,其結(jié)構(gòu)為：其中R為探針1：或探針2：其合成原料廉價(jià)、方法簡(jiǎn)單。此類探針，在水溶液中呈現(xiàn)出～460nm的藍(lán)色熒光，而在甲醇，二甲基亞砜，N,N?二甲基甲酰胺等極性溶劑中呈現(xiàn)出525?560nm的綠色到黃色熒光。將此類探針引入SNAP?tag蛋白后，探針熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)且長(zhǎng)波長(zhǎng)(～550nm)處熒光比例明顯增加。該類探針可應(yīng)用蛋白標(biāo)記及檢測(cè)、生物熒光成像等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于蛋白標(biāo)記的新型熒光探針的合成方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著分子生物學(xué)，分析化學(xué)以及有機(jī)化學(xué)的逐步發(fā)展，研究工作者對(duì)蛋白功能及結(jié)構(gòu)的研究，含量的檢測(cè)，實(shí)時(shí)的追蹤的需求極為迫切。因而，有機(jī)小分子熒光探針作為一種重要的蛋白標(biāo)記手段逐漸被廣泛應(yīng)用于蛋白的監(jiān)測(cè)。近年來，有機(jī)小分子熒光探針對(duì)蛋白的標(biāo)記主要通過共價(jià)鍵(雙砷-四半胱氨酸體系、SNAP-tag、Halo-tag等)，非共價(jià)鍵(氫鍵，金屬配位等)以及基因工程(非天然氨基酸等)等對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行修飾而達(dá)到熒光標(biāo)記的效果。

SNAP-tag蛋白是對(duì)由207個(gè)氨基酸組成的DNA修復(fù)蛋白酶(O⁶-鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶，hAGT)進(jìn)行突變改造而獲得的。其中作為反應(yīng)位點(diǎn)的半胱氨酸能夠與O⁶修飾的苯甲基鳥嘌呤進(jìn)行親核反應(yīng)。脫去鳥嘌呤后，半胱氨酸能夠與芐基形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而以共價(jià)鍵形式達(dá)到與熒光底物高特異性的結(jié)合。因此，通過有機(jī)合成手段可以將多種多樣的有機(jī)小分子熒光探針引入芐基端，從而達(dá)到熒光探針與SNAP-tag蛋白的特異性結(jié)合。

有機(jī)小分子熒光探針作為蛋白的標(biāo)記和檢測(cè)手段的實(shí)例以屢見不鮮，但是在諸多熒光探針中其主要表現(xiàn)為與蛋白結(jié)合后出現(xiàn)熒光增強(qiáng)并伴有熒光的藍(lán)移，這種探針容易受到設(shè)備、樣品等外界因素影響。比率型的熒光探針能很好地克服這類缺點(diǎn)，但是成功用于蛋白標(biāo)記與檢測(cè)的卻較為少見。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一類用于蛋白標(biāo)記的熒光探針的生物應(yīng)用，該探針能夠與SNAP-tag蛋白特異性結(jié)合并呈現(xiàn)出長(zhǎng)波～550nm處的熒光增強(qiáng)。

本發(fā)明的另一目的是提供一類用于蛋白標(biāo)記的熒光探針的合成方法，該方法具有操作方便、原料廉價(jià)、提純簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供一種用于熒光標(biāo)記的熒光探針，以4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酰亞胺為熒光基團(tuán)，芐氧基為結(jié)合位點(diǎn)，熒光探針能夠特異性與SNAP蛋白結(jié)合并呈現(xiàn)～8倍熒光增強(qiáng)，其在～550nm處熒光強(qiáng)度比例明顯增加。

該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)：

其中R為R1：或R2：中的一種或二種；當(dāng)R為R1時(shí)，探針為探針1，當(dāng)R為R2時(shí)，探針為探針2，結(jié)構(gòu)為：

用于蛋白標(biāo)記及檢測(cè)的熒光探針合成路線，如下：

具體合成步驟如下：

(1)中間體4-疊氮基-1,8-萘酐的合成：

將4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反應(yīng)液。疊氮化鈉溶于水中，滴加至反應(yīng)液，加熱至90-100℃，持續(xù)4-8h，冷卻，倒入200-300mL冰水中抽濾，得4-疊氮基-1,8-萘酐。

(2)中間體4-氨基-1,8-萘酐的合成：

將4-疊氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化鈉。加熱至50-70℃，持續(xù)8-20h，冷卻，倒入200-300mL冰水中，抽濾得4-氨基-1,8-萘酐。

(3)中間體4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：