[發明專利]一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法

在審

• 申請號: 201510918697.5
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105420269A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 孫付保;白仁惠;張震宇;許銀彪;王春迪
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種共表達透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)和纖維素酶蛋白的重組畢赤酵母系統的構建，屬于生物工程技術領域。

背景技術

纖維素酶是一類多組分酶的總稱，能夠將難以被生物利用的纖維素水解為利于被生物利用的葡萄糖，因此被認為是潛力巨大的酶制劑之一。纖維素酶屬于糖苷水解酶，能夠降解纖維素的纖維素酶系至少包括三類組分，分別為葡聚糖外切酶(CBH)，葡聚糖內切酶(EG)以及β-葡萄糖苷酶(BG)。其中EG作用于纖維素非結晶區，水解β-1,4糖苷鍵，可將線性纖維素多聚物截斷生成大量纖維素小分子；CBH水解1,4-β-D-糖苷鍵，作用于線性纖維素多聚物末端，生成纖維二糖分子；BG則將纖維二糖水解成為葡萄糖。通過纖維素酶復合酶組分相互協同作用，可以將地球上最豐富的生物高聚物—纖維素，轉化為微生物可以輕易利用的葡萄糖，通過發酵產生生物燃料，用以緩解目前能源短缺問題。

纖維素酶來源廣泛，產生纖維素酶的生物包括昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌和真菌。然而，這些自產酶天生具有一定的配比缺陷，就目前工業應用最為廣泛的產纖維素酶真菌里氏木霉(Trichodermareesei)而言，其纖維素酶系中缺乏外切酶CBHII和β-葡萄糖苷酶BG，導致其纖維素酶系酶解效率低下。另外，無論是來源于生物的自產酶系還是人工制成的商業纖維素酶系，其中所含蛋白多達八十余種，甚至更多，導致核心酶組分比酶活降低，這同樣也是纖維素酶系酶解效率低下的原因。更為重要的是，不同木質纖維素材料中纖維素、半纖維素以及木質素的比例有顯著差異，導致同一類商業纖維素酶制劑或自產酶并不能發揮最佳的酶解效果。所以，優化定制纖維素酶，使各組分達到最佳配比，才能在最少酶用量時獲得最優的水解效果。因此，為了優化定制纖維素酶，獲得纖維素酶單酶組分十分關鍵。

近些年來，異源表達纖維素酶基因獲得單酶組分是研究熱點。Pichiapastoris可以實現翻譯后修飾作用，如糖基化、二硫鍵形成，使蛋白可以進行正確折疊，并獲得有活性的目標蛋白，另外，畢赤酵母并不產生內源性木質纖維素酶組分，且胞外蛋白成分并不復雜，重組畢赤酵母菌發酵上清液甚至可以不經過純化直接作為單酶制劑進行使用，因此，以Pichiapastoris作為首選宿主菌，實現纖維素酶組分異源表達以獲得高濃度和高純度的纖維素酶蛋白組分，已成為研究熱點。

資料表明，透明顫菌血紅蛋白(VHb)產自嚴格好氧細菌透明顫菌，VHb是在透明顫菌處于缺氧狀態時的一種自動急救蛋白。關于其功能的假說表明VHb能在低氧環境中捕獲氧氣，供給與呼吸作用相關的氧化酶，從而提高呼吸效率并促進ATP的生成。以畢赤酵母作為宿主菌實現纖維素酶蛋白組分異源表達，其工業化的前提是必須在氧氣供應不足的高密度培養方面具有優質潛力，通過在畢赤酵母中實現VHb與纖維素酶蛋白的共表達，可以提高重組畢赤酵母的產酶水平以及工業化應用潛力。

發明內容：

本發明的目的在于構建一種共表達透明顫菌血紅蛋白基因和纖維素酶蛋白基因的畢赤酵母。

本發明提供的共表達VHb蛋白和葡聚糖內切酶II的畢赤酵母系統具體步驟如下：

1、EGII密碼子偏向性優化：

本發明實現了EGII密碼子偏向性優化，其原始密碼子序列如下：

SEQIDNO.1

密碼子優化前EGII氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

SEQIDNO.2

本發明利用GeneDesigner(DNA2.0,MenloPark,CA,USA)實現對SEQIDNO.1所示的EGII核苷酸序列密碼子偏向性優化，優化后核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

SEQIDNO.3

經過密碼子優化后，EGII氨基酸序列與SEQIDNO.2相同。

2、構建表達載體pPIC9K-eg2：

以質粒pPIC9K作為載體，將優化后的EGII基因插入啟動子AOX1下游，5’端酶切位點為EcoRI，3’端酶切位點為NotI，構建pPIC9K-eg2表達載體。

3、獲取重組菌株：

以SacI作為pPIC9K-eg2表達載體線性化位點，實現表達載體線性化，通過電轉化轉入畢赤酵母。

4、獲得vgb基因：