[發(fā)明專利]一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法

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• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105420269A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設計）人: 孫付保;白仁惠;張震宇;許銀彪;王春迪
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其特征在于如下步驟：

1)密碼子偏向性優(yōu)化：本發(fā)明利用軟件GeneDesigner實現(xiàn)對SEQIDNO.1所示的EGII核苷酸序列密碼子偏向性優(yōu)化，優(yōu)化后核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

2)pPIC9K-eg2表達載體構建：以質粒pPIC9K為載體，將優(yōu)化后的EGII基因插入啟動子AOX1下游，5’端酶切位點為EcoRI，3’端酶切位點為NotI，構建pPIC9K-eg2表達載體。

3)獲取重組菌株：以SacI作為pPIC9K-eg2表達載體線性化位點，實現(xiàn)表達載體線性化，通過電轉化轉入畢赤酵母。

4)獲得vgb基因：從NCBI中獲取透明顫菌血紅蛋白基因，在5’端添加EcoRI酶切位點，3’端添加NotI酶切位點，通過人工合成獲得目的基因。

5)pPICZαA-vgb表達載體構建：以質粒pPICZαA作為載體，將vgb基因插入啟動子AOX1下游，5’端酶切位點為EcoRI，3’端酶切位點為NotI，構建pPICZαA-vgb表達載體。

6)通過高濃度遺傳霉素G-418與博來霉素雙抗性篩選得到高拷貝共表達菌株。

7)比較EGII重組菌株與EGII和VHb共表達菌株的產酶水平。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟1)密碼子偏向性優(yōu)化，密碼子主要是指編碼內切纖維素酶、外切纖維素酶、β-葡萄和糖苷酶，以及木聚糖酶和木糖苷酶，另外也涉及半纖維素側鏈水解相關的酶類。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其描述的共表達重組菌株，是指重組畢赤酵母菌。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其重組菌株能夠穩(wěn)定高效表達纖維素酶蛋白，且共表達畢赤酵母菌株在纖維素酶蛋白的同時能夠產有活性的VHb蛋白。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟1)的EGII是由如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示核苷酸序列所編碼的里氏木霉葡聚糖外切酶II基因。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟1)中描述的EGII基因密碼子偏向性優(yōu)化，優(yōu)化后EGII核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟1)中描述的EGII基因，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟2)中描述的表達載體，為pPIC9K-eg2表達載體。

9.根據(jù)權利要求1所述的一種畢赤酵母中共表達血紅蛋白VHb和纖維素酶蛋白的構建方法，其步驟5)中描述的表達載體，為pPIC9K-vgb表達載體。