[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速鑒定雙歧桿菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510917117.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105385762A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳衛(wèi);趙國(guó)忠;韓俊燕;印伯星;房東升;張秋香;張白曦;田豐偉;范大明;劉小鳴;王剛;郭敏;趙建新;張灝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司;江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及雙歧桿菌，尤其是一種快速鑒定雙歧桿菌的分子生物學(xué)方法。

背景技術(shù)

雙歧桿菌是一類(lèi)厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，按照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)的分類(lèi)，雙歧桿菌屬于放線(xiàn)菌目放線(xiàn)菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌為外觀(guān)變化很大的桿狀體，菌株的一般特征是呈分叉的Y型或V型，以及棍棒狀或者匙狀類(lèi)型。1899年，法國(guó)巴斯德研究院人員首先從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離出了第一株雙歧桿菌，之后越來(lái)越多的科學(xué)家及研究者們開(kāi)始了對(duì)雙歧桿菌的研究工作。并且實(shí)踐表明，雙歧桿菌是存在于人和其它動(dòng)物腸道內(nèi)的一類(lèi)有益菌，人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，在嬰幼兒時(shí)期含量最為豐富，隨著年齡的增長(zhǎng)，比例逐漸縮小。定殖于人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌，在抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、改善便秘、緩解由抗生素引起的腹瀉、提高宿主免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用。

隨著對(duì)雙歧桿菌研究的深入，以及對(duì)雙歧桿菌類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，如何快速獲得具有潛在益生特性的雙歧桿菌菌株成為亟待解決的問(wèn)題。而對(duì)于雙歧桿菌的鑒定，是其中不可或缺的重要部分。目前，對(duì)于雙歧桿菌的菌種鑒定，常用的方法主要有兩種：一是基于形態(tài)學(xué)和生理生化特性(主要是糖代謝不同)進(jìn)行的傳統(tǒng)鑒定方法；二是基于分子生物學(xué)手段，對(duì)菌株的基因進(jìn)行測(cè)定，其中最常用的是PCR擴(kuò)增雙歧桿菌的16SrDNA片段，將雙歧桿菌鑒定到種的水平。然而，這兩種方法在一定程度上都存在某種不可避免的缺陷性。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法，由于雙歧桿菌的形態(tài)多變性以及代謝底物的細(xì)微差別，很難將雙歧桿菌鑒定到種的水平。并且存在工作量大，費(fèi)事費(fèi)力的缺點(diǎn)。而采用16SrDNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法，雖然可以準(zhǔn)確鑒定到種，但存在程序繁瑣的缺點(diǎn)。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)的工作原理是，根據(jù)DNA的解鏈特性，不同堿基組成的雙螺旋DNA發(fā)生變性所需變性劑的濃度不同。混合的雙鏈DNA在進(jìn)行變性劑濃度呈線(xiàn)性變化的電泳時(shí)，相同堿基組成的DNA在同一變性劑濃度的位置發(fā)生解鏈，不同堿基組成的DNA在不同變性劑濃度的位置發(fā)生解鏈，由于遷移速率的不同而停留在凝膠中的不同位置，從而將混合的DNA片段分離開(kāi)來(lái)。此技術(shù)可以將僅有一對(duì)堿基差別的DNA片段分離開(kāi)來(lái)。而雙歧桿菌的16SrDNA的V3區(qū)為高度可變區(qū)，理論上可以通過(guò)DGGE手段將不同種的雙歧桿菌鑒定出來(lái)。

通過(guò)檢索，發(fā)現(xiàn)如下一篇與本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)相關(guān)的專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)：

一種鑒定雙歧桿菌的方法(CN102108400A)，涉及一種鑒定雙歧桿菌的方法，具體涉及一種新的鑒定雙歧桿菌的分子生物學(xué)方法。該方法通過(guò)對(duì)雙歧桿菌16SrDNA上兩段目標(biāo)基因片段及丙酮酸激酶編碼基因上一段目標(biāo)基因片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，可以將雙歧桿菌菌株鑒定到種的水平。本發(fā)明將為雙歧桿菌鑒定提供一種更加準(zhǔn)確、更易于操作的實(shí)用方法，有利于雙歧桿菌菌株的分類(lèi)及研究工作。

通過(guò)對(duì)比，本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)與上述專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種快速、準(zhǔn)確地鑒定雙歧桿菌的方法，該方法可以將雙歧桿菌鑒定到種或亞種的水平，為雙歧桿菌的分離鑒定及進(jìn)一步研究提供一種可靠手段。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種快速鑒定雙歧桿菌的方法，采用PCR-DGGE的方法，將未知菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的條帶進(jìn)行比對(duì)，將未知雙歧桿菌鑒定到種或亞種的水平。

而且，步驟如下：

⑴提取已知基因序列的不同種雙歧桿菌的基因組；

⑵采用合適引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增單菌的16SrDNA的V3區(qū)；

⑶采用變性梯度凝膠電泳方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

⑷將未知的雙歧桿菌條帶與標(biāo)準(zhǔn)條帶進(jìn)行比對(duì)，確定未知雙歧桿菌的種類(lèi)。

而且，所述步驟⑴中已知基因序列的雙歧桿菌為短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

而且，所述步驟⑴中提取雙歧桿菌基因組的方法是酚-氯仿抽提法。

而且，所述步驟⑵中引物對(duì)為338f-GC和518r。

而且，所述引物338f-GC的堿基序列為5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；引物518r的堿基序列為5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。