[發(fā)明專利]一種快速鑒定雙歧桿菌的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510917117.0
• 申請日: 2015-12-10
• 公開（公告）號: CN105385762A
• 公開（公告）日: 2016-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳衛(wèi);趙國忠;韓俊燕;印伯星;房東升;張秋香;張白曦;田豐偉;范大明;劉小鳴;王剛;郭敏;趙建新;張灝
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司;江南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：采用PCR-DGGE的方法，將未知菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的條帶進(jìn)行比對，將未知雙歧桿菌鑒定到種或亞種的水平。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：步驟如下：

⑴提取已知基因序列的不同種雙歧桿菌的基因組；

⑵采用合適引物對，進(jìn)行PCR擴增單菌的16SrDNA的V3區(qū)；

⑶采用變性梯度凝膠電泳方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

⑷將未知的雙歧桿菌條帶與標(biāo)準(zhǔn)條帶進(jìn)行比對，確定未知雙歧桿菌的種類。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑴中已知基因序列的雙歧桿菌為短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌嬰兒亞種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑴中提取雙歧桿菌基因組的方法是酚-氯仿抽提法。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑵中引物對為338f-GC和518r。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述引物338f-GC的堿基序列為SEQ1；引物518r的堿基序列為SEQ2。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑵中PCR的擴增條件為：95℃，5min；94℃，45s，65℃，45s，每個循環(huán)降0.5℃，72℃，30s，20個循環(huán)；94℃，50s，55℃55s，72℃30s，15個循環(huán)；72℃10min。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑶中變性梯度凝膠電泳方法所用的膠為30％～70％的聚丙烯酰胺。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：所述步驟⑶中變性梯度凝膠電泳方法的電泳條件是：120V，30min；80V，12h；緩沖液為1×TAE；溫度為60℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的快速鑒定雙歧桿菌的方法，其特征在于：具體步驟如下：

(一)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：MRS+5‰半胱氨酸，121℃滅菌15min；培養(yǎng)條件：37℃，取已知基因序列的不同種雙歧桿菌于厭氧工作站培養(yǎng)24h，得菌懸液；

(二)基因組提取

⑴取培養(yǎng)過夜的菌懸液1mL于1.5mL離心管，10000rpm離心2min，棄上清得菌體；

⑵用1mL無菌水吹打洗菌體后，10000rpm離心2min，棄上清得菌體；

⑶向菌體中加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min，得菌體裂解液；

⑷加入酚-氯仿溶液200uL于菌體裂解液中，其中酚-氯仿溶液的組成成分及體積比為：Tris飽和酚：氯仿：異戊醇＝25：24：1，顛倒混勻后，12000rpm離心5-10min，取上清200uL；

⑸加入400uL冰乙醇或冰異丙醇于200uL上清中，-20℃靜置1h，12000rpm離心5-10min，棄上清；

⑹加入500uL體積百分?jǐn)?shù)為70％的冰乙醇重懸沉淀，12000rpm離心1-3min，棄上清；

⑺60℃烘箱烘干，或者自然晾干，得沉淀；

⑻50uLddH₂O重溶沉淀，以備PCR；

(三)16SrDNAV3區(qū)引物

上游引物338f-GC，堿基序列：SEQ1；

下游引物518r，堿基序列：SEQ2；

(四)PCR反應(yīng)體系50μL：

10×Taqbuffer，5μL；dNTP，5μL；338f-GC20μM，0.5μL；518r20μM，0.5μL；Taq酶，0.5μL；DNA模板，0.5μL；ddH₂O，38μL；

(五)PCR反應(yīng)程序

95℃，5min；94℃，45s，65℃，45s每個循環(huán)降0.5℃，72℃，30s，20個循環(huán)；94℃，50s，55℃55s，72℃30s15個循環(huán)；72℃，保持10min；

(六)瓊脂糖電泳

⑴配制質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1％的瓊脂糖凝膠：每大膠40mL，稱取0.4g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入40mL的0.5×TBE，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，待溶液冷至不燙手，加入4μL10000×的核酸染料，混勻后倒入模具中，凝固30min以上；

⑵將基因組DNA樣品/PCR產(chǎn)物樣品與10×Loadingbuffer混合后，加入樣品槽中；

⑶接通電源，120V，跑30min；

⑷電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀拍照；

(七)變性梯度凝膠電泳的操作

⑴溶液配制

①50×TAE電泳緩沖液：tris242g，Na₂EDTA·2H₂O37.2g，加800mL去離子水，充分混勻，加57.1mL冰醋酸，充分混勻，加去離子水至1L，混合；

②0％變性劑100mL：質(zhì)量百分?jǐn)?shù)40％的丙烯酰胺，20mL；50×TAE電泳緩沖液，2mL；dH₂O，78mL，過0.45μm濾膜，超聲脫氣10-15min，置于棕色試劑瓶中；

③100％變性劑100mL：質(zhì)量百分?jǐn)?shù)40％的丙烯酰胺，20mL；50×TAE電泳緩沖液，2mL；甲酰胺，40mL；尿素，42g；dH₂O，至100mL，過0.45μm濾膜，超聲脫氣10-15min，置于棕色試劑瓶中，使用前須在溫水浴中重溶；

④10％過硫酸銨：0.1g過硫酸銨溶解于1mLdH₂O中，-20℃儲存；

⑵制膠

①將兩片大小不一致的玻璃板清洗干凈，干燥；

②將兩個間隔條置于大塊玻璃板兩側(cè)邊緣，外邊緣與玻璃板邊緣相齊，間隔條的槽朝上，將小塊玻璃板置于間隔條上，并與之對齊，并將該夾層結(jié)構(gòu)用夾子固定好，豎起后中間插入校準(zhǔn)板校正，兩邊固定螺絲旋緊；

③將海綿墊固定在制膠架上，將夾層結(jié)構(gòu)連同夾子一起固定在制膠架上，加入去離子水，驗漏，確定不漏后將水倒掉并用濾紙將殘留的水吸干；

④分別配制30％和70％的凝膠，其中，30％的膠：0％變性劑，14mL；100％變性劑，6mL；四甲基乙二胺，10μL；10％過硫酸銨，80μL；

70％的膠：0％變性劑，6mL；100％變性劑，14mL；四甲基乙二胺，10μL；10％過硫酸銨，80μL；

⑤兩個注射器分別吸入30％和70％的凝膠后，排出氣泡，按照頂部進(jìn)膠的低濃度和高濃度固定在梯度傳送系統(tǒng)上，連接上Y形管，小心趕走氣泡；

⑥針頭對準(zhǔn)玻璃板中心位置，針孔朝向大塊玻璃板，輕柔并穩(wěn)定地旋轉(zhuǎn)凸輪來傳送溶液，保持勻速，使溶液恒速被灌入三明治式的凝膠板中；

⑦小心插入梳子，讓凝膠聚合一個小時，迅速清洗用完的設(shè)備，尤其是洗掉Y形管中殘留的液體，以免堵塞；

⑧電泳槽內(nèi)加入7L1×TAE緩沖溶液，其由50×TAE緩沖溶液稀釋而得，打開電泳控制裝置，預(yù)熱電泳緩沖液到60℃；

⑨聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，清洗點樣孔，蓋上溫度控制裝置使溫度上升到60℃；

⑶上樣：PCR產(chǎn)物中加了加樣緩沖液后，每個膠孔加20μL；

⑷電泳：120V，30min后80V，12h，遵循的原則為電壓V×?xí)r間h為1000；

⑸染色

①電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后連同另一塊玻璃板將膠放入托盤中，膠朝上；

②GelRed稀釋液：30mL水+3μL10000×GelRed混勻，即得，避光保存；

③用1mL的移液器將GelRed稀釋液分3次加到膠上，每次10mL，須覆蓋點樣孔對應(yīng)區(qū)域，每次加完后等10min，托盤須蓋上蓋子避光；

④加去離子水沒過膠，避光30min；

⑤輕輕晃動托盤，使水進(jìn)入膠和玻璃板之間，慢慢使其分離，取出玻璃板；

⑹顯影：凝膠成像儀下紫外顯影，拍照；

(八)未知雙歧桿菌的DGGE鑒定

按照實施例(二)至(六)的操作步驟，獲得未知雙歧桿菌的16SrDNAV3區(qū)的PCR產(chǎn)物；

以雙歧桿菌的混合標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜作為Marker，對未知的雙歧桿菌進(jìn)行鑒定。