[發明專利]一種高效表達羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌

在審

• 申請號: 201510908140.3
• 申請日: 2015-12-10
• 公開（公告）號: CN105296374A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 杜婕;蔣伶活
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P21/02;A23K20/195;A23K50/80;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

技術領域

本發明涉及一種高效表達羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌，屬于生物技術領域。

背景技術

水產養殖業是我國經濟出口創匯的重要產業之一，漁業在我國已成為農業經濟的增長點。近年來甲殼類動物病害日趨嚴重，給我國水產養殖業帶來巨大的經濟損失。

甲殼類動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非特異性免疫系統，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。甲殼動物的抗菌肽，是具有較高抗菌活性，水溶性好，熱穩定的免疫效應因子，能夠直接殺死或者清除病原微生物，是甲殼動物先天免疫系統中的重要組成部分。多數抗菌肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有不同程度的殺菌或者抑菌作用。

甲殼素(Crustin)是蝦蟹中研究較多的抗菌肽。目前，利用釀酒酵母對羅氏沼蝦Crustin蛋白進行真核表達及蛋白功能研究還未見報道。然而，基因的異源表達受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的影響。因此，如何實現甲殼類動物來源的甲殼素Crustin的異源表達、活性表達、高效表達是目前亟需解決的問題。

發明內容

為了解決上述問題，本發明利用釀酒酵母實現了羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)重要免疫因子-甲殼素Crustin的異源表達、活性表達、高效表達，對增強甲殼類動物對各種主要疾病和環境變化的抵抗力、有效促進其健康生長發揮了重要作用。

本發明的第一個目的是提供一種高效表達羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌，所述工程菌的構建方法是將羅氏沼蝦甲殼素Crustin的cDNA克隆至表達質粒pHAC181上得到測序驗證正確的重組質粒pHAC181-MrCrustin(MrCrustin即代表來源于羅氏沼蝦的Crustin)，然后設計同源重組引物，利用同源重組技術將目的基因MrCrustin整合至釀酒酵母宿主菌株的GAL1啟動子下游。該工程菌在半乳糖的誘導下，可高效表達目的蛋白。

在本發明的一種實施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS區域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS區域(codingsequence)翻譯后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述表達質粒pHAC181是在商業化質粒YCplac181的SphI和EcoRV位點插入3個組氨酸標簽得到的，詳見文獻：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2p^DD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.

在本發明的一種實施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GAL1-ScRCH1，是將釀酒酵母BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的啟動子替換成GAL1啟動子。

在本發明的一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構建得到的：(1)以羅氏沼蝦的cDNA為模板PCR擴增或者直接化學合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的MrCrustin基因片段；(2)將MrCrustin基因片段克隆到表達質粒pHAC181上，得到重組表達質粒pHAC181-MrCrustin；(3)設計同源重組引物，對質粒pHAC181-MrCrustin進行擴增，得到含有MrCrustin基因的核苷酸片段，使用同源重組的方法，將該核苷酸片段整合至釀酒酵母菌株中GAL1啟動子下游。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(3)，還包括將菌株在YPG培養基中誘導培養6h后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT檢測，目的蛋白表達的菌株則為構建成功的酵母工程菌。

本發明的第二個目的是提供一種高效表達羅氏沼蝦甲殼素MrCrustin的方法，所述方法是使用所述釀酒酵母工程菌為生產菌株。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG培養基中，在半乳糖的誘導下培養6h；所述YPG培養基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L。