[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510908140.3
• 申請日: 2015-12-10
• 公開（公告）號: CN105296374A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜婕;蔣伶活
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P21/02;A23K20/195;A23K50/80;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國經(jīng)濟(jì)出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)之一，漁業(yè)在我國已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的增長點(diǎn)。近年來甲殼類動物病害日趨嚴(yán)重，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

甲殼類動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。甲殼動物的抗菌肽，是具有較高抗菌活性，水溶性好，熱穩(wěn)定的免疫效應(yīng)因子，能夠直接殺死或者清除病原微生物，是甲殼動物先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分。多數(shù)抗菌肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有不同程度的殺菌或者抑菌作用。

甲殼素(Crustin)是蝦蟹中研究較多的抗菌肽。目前，利用釀酒酵母對羅氏沼蝦Crustin蛋白進(jìn)行真核表達(dá)及蛋白功能研究還未見報道。然而，基因的異源表達(dá)受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的影響。因此，如何實(shí)現(xiàn)甲殼類動物來源的甲殼素Crustin的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)是目前亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明利用釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)重要免疫因子-甲殼素Crustin的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)，對增強(qiáng)甲殼類動物對各種主要疾病和環(huán)境變化的抵抗力、有效促進(jìn)其健康生長發(fā)揮了重要作用。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼蝦甲殼素的釀酒酵母工程菌，所述工程菌的構(gòu)建方法是將羅氏沼蝦甲殼素Crustin的cDNA克隆至表達(dá)質(zhì)粒pHAC181上得到測序驗證正確的重組質(zhì)粒pHAC181-MrCrustin(MrCrustin即代表來源于羅氏沼蝦的Crustin)，然后設(shè)計同源重組引物，利用同源重組技術(shù)將目的基因MrCrustin整合至釀酒酵母宿主菌株的GAL1啟動子下游。該工程菌在半乳糖的誘導(dǎo)下，可高效表達(dá)目的蛋白。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS區(qū)域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS區(qū)域(codingsequence)翻譯后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)質(zhì)粒pHAC181是在商業(yè)化質(zhì)粒YCplac181的SphI和EcoRV位點(diǎn)插入3個組氨酸標(biāo)簽得到的，詳見文獻(xiàn)：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2p^DD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GAL1-ScRCH1，是將釀酒酵母BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的啟動子替換成GAL1啟動子。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構(gòu)建得到的：(1)以羅氏沼蝦的cDNA為模板PCR擴(kuò)增或者直接化學(xué)合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的MrCrustin基因片段；(2)將MrCrustin基因片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒pHAC181上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pHAC181-MrCrustin；(3)設(shè)計同源重組引物，對質(zhì)粒pHAC181-MrCrustin進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有MrCrustin基因的核苷酸片段，使用同源重組的方法，將該核苷酸片段整合至釀酒酵母菌株中GAL1啟動子下游。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)，還包括將菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT檢測，目的蛋白表達(dá)的菌株則為構(gòu)建成功的酵母工程菌。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼蝦甲殼素MrCrustin的方法，所述方法是使用所述釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)菌株。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG培養(yǎng)基中，在半乳糖的誘導(dǎo)下培養(yǎng)6h；所述YPG培養(yǎng)基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L。