[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510907693.7
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN105349529A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳凱;李丹;程亮;王寶中;張琳
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇正大天創(chuàng)生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)基于其快速、簡便、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，自1989年開始就被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測和臨床檢驗(yàn)，隨后很快地成為醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)的主要檢測手段之一。

DNA核酸擴(kuò)增，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段。利用DNA在體外高溫時變性會變成單鏈，低溫時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。PCR的特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、純度要求低，廣泛用于各種疾病和腫瘤等的檢測。

RNA核酸擴(kuò)增，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄體系和DNA擴(kuò)增體系相結(jié)合的技術(shù)。能夠?qū)崿F(xiàn)一步對RNA進(jìn)行檢測，不但操作方便，靈敏度也得到了很大的提升，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，已廣泛用于涉及到核酸的科學(xué)研究以及臨床疾病的診斷和治療監(jiān)測。

核酸分子診斷成為了診斷試劑行業(yè)的發(fā)展方向，熒光定量核酸診斷試劑是目前市場上最先進(jìn)的診斷試劑。常規(guī)檢測的乙肝、丙肝、艾滋、也可用于醫(yī)院、疾控等臨床樣本中對各種各樣的細(xì)菌、病毒感染等疾病的檢測。而且相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)、鏡檢、免疫學(xué)方法等來說，核酸診斷具有其他方法無法替代的靈敏和及時等優(yōu)點(diǎn)。

核酸診斷被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測上，但是核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑在常溫下保存不穩(wěn)定，幾周就失效了；在2～8℃條件下保存，保存期也只有三個月左右；-20℃條件下的保存期雖然可以達(dá)到一年之久，但是每次使用必須要反復(fù)凍融，這對試劑的活性也有很大的影響，并且各組分不能混合一起，用時需混合，操作麻煩等缺點(diǎn)，試劑盒的長期保存和長途運(yùn)輸將會受到很大的限制，容易因診斷試劑保存溫度不當(dāng)而使其敏感性下降甚至完全失效，最終導(dǎo)致疫病的檢測不及時而造成疫病流行。

目前，市場上核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑缺少能在4℃或室溫長期保存的方法，這也限制了核酸診斷試劑產(chǎn)品的市場。。

核酸技術(shù)作為一種新生的高新技術(shù)，代表臨床實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)發(fā)展的又一里程碑，十多年的臨床實(shí)踐表明，熒光定量核酸診斷技術(shù)已在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)檢測和臨床診斷中占據(jù)主導(dǎo)地位，因此開發(fā)適用于熒光定量核酸試劑常溫保存的相關(guān)技術(shù)已迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：提供了一種應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑。本發(fā)明凍干保護(hù)劑為應(yīng)用于熒光定量核酸診斷試劑的凍干技術(shù)提供了一種有效的、可以實(shí)現(xiàn)的凍干體系。診斷試劑通過冷凍干燥的技術(shù)，液體試劑變成凍干粉，以凍干粉的形式能更穩(wěn)定的保存，達(dá)到現(xiàn)階段核酸診斷試劑無法達(dá)到的常溫運(yùn)輸和常溫保存的目的，也減少了試劑反復(fù)凍融。檢測時只需一步水化再加入樣本即可以實(shí)現(xiàn)檢測目的，操作簡單。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑，包括以下組份中的一種或多種：海藻糖、焦磷酸二乙酯處理過的水。

所述核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑進(jìn)一步包括以下組分：蔗糖和/或乳糖。

所述核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑不包括甘露醇。在本發(fā)明核酸擴(kuò)增體系的試驗(yàn)中，加入甘露醇作為凍干保護(hù)劑的效果遠(yuǎn)不如本發(fā)明采用的海藻糖、蔗糖、和/或乳糖體系。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種如前述中任一項(xiàng)所述應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑的制備方法，包括以下步驟：將所述組份按照使用的濃度比混勻，即得到凍干保護(hù)劑。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種如前述任一項(xiàng)所述應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將所述組份按照使用的濃度比混勻；

步驟2：冷凍干燥，即得到凍干保護(hù)劑。

所述冷凍干燥的步驟，進(jìn)一步包括以下子步驟：

子步驟1：干燥的步驟；

子步驟2：凍干的步驟；

所述子步驟1中，凍干劑和核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑的體積比為3.5-7：13-16.5，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑為RNA或DNA實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)試劑；

所述子步驟1中，所述干燥的步驟采用冷凍真空干燥；

所述步驟2中，所述凍干的方法包括以下階段：

預(yù)凍階段：隔板溫度下降到-45℃－-55℃，保持時間3-5h；

一次升華階段：保持2-4h；

二次升華階段：保持2-4h；

終干燥階段：保持2-3h。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種所述應(yīng)用于核酸擴(kuò)增體系的凍干保護(hù)劑的使用方法，包括以下步驟：