[發明專利]一種大鼠肝S9的誘導及制備方法

在審

• 申請號: 201510907047.0
• 申請日: 2015-12-07
• 公開（公告）號: CN106834206A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 田瑞;張亞洲;蔣敏;齊來俊
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C07K14/47;C12N9/02
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技術領域

本發明屬于蛋白酶學領域，具體涉及一大鼠肝S9的誘導及制備方法。

背景技術

大鼠肝細胞S9是大鼠肝實質細胞勻漿液的去線粒體上清液，包含了大量的CYPs等藥物代謝酶，其在藥物體外代謝的研究中具有快速簡便、靈敏、經濟且可進行高通量篩選的特點，因此常用作體外研究藥物代謝和藥物相互作用的工具。同時許多致癌劑的生物轉化是依靠細胞內微粒體混合功能氧化酶系來完成的，所以大鼠肝S9是許多體外研究致癌劑生物轉化的活化系統。傳統的大鼠肝S9誘導劑為多氯聯苯，其誘導效果比單獨用苯巴比妥鈉或β-奈黃酮要好，但其是致癌劑，一種嚴重的環境污染物，現許多國家已禁止生產。現研究表明聯合誘導法可以達到多氯聯苯誘導的效果，本發明通過優化苯巴比妥和β-奈黃酮聯合誘導法以及大鼠肝S9制備方法可以獲得高產量的大鼠肝S9以及較高的P450酶含量。

發明內容

本發明的目的是建立一種可以獲得高產量的大鼠肝S9以及較高的P450酶含量的大鼠肝S9制備方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發明采取如下方法制備大鼠肝S9：

大鼠肝S9的誘導及制備方法的步驟包括：(a)挑選大鼠，按照大鼠的體重，用不同的方式和劑量腹腔注射兩種誘導劑以確定最佳誘導方法；(b)處死大鼠， 在無菌條件下，除去肝中殘血，取出肝臟；(c)在無菌條件下，按一定的肝濕重比加入預冷的儲存緩沖液中，充分剪碎，在冰浴中勻漿；(d)將勻漿好的組織液低速離心，收集上清和沉淀，并將上清高速離心收集上清，即首次獲得的大鼠肝S9；(e)將收集的沉淀，按一定的比重加入預冷的儲存緩沖液，在無菌和冰浴條件下充分研磨并在不同條件下超聲破碎細胞，將其在高速離心收集上清，即再次獲得肝S9；(f)BCA法和CO還原法檢測不同條件下大鼠肝S9蛋白以及酶含量。

可選的大鼠為SD雄性大鼠，體重為230±20g；

可選的誘導劑為苯巴比妥鈉和β-奈黃酮；

可選的誘導方法為第1d大鼠腹腔注射劑量為30mg/kg的苯巴比妥鈉和劑量為40mg/kg的β-萘黃酮，第2d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第3d注射劑量為60mg/kg的苯巴比妥鈉，第4d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第5d注射苯巴比妥鈉60mg/kg；

可選的除去肝中殘血的方法是將事先冰浴的肝素液經肝門靜脈灌洗除去殘血：

可選的加入預冷的儲存緩沖液的量是肝濕重的3倍(V/m)；

可選的儲存緩沖液為0.15M KCl(pH 7.4)；

可選的低速離心勻漿液，其離心速度為1500rpm/min，時間5min；

可選的肝S9高速離心，其離心速度為9000g，時間20min；

可選的加入預冷的儲存緩沖液的量是沉淀重量的2倍(V/m)；

可選的超聲條件分別為34w/50w/65w超聲功率下，超聲10s，間隔5s的條件下，超聲20次；

本發明提供了一聯合誘導方法，大大提高了大鼠肝S9的P450酶含量，并通 過大鼠肝S9制備方法的優化，提高了大鼠肝S9的產量。

附圖說明

圖1：三種誘導方法所產生大鼠肝S9的P450酶含量；

圖2：不同超聲破碎條件下產生的總蛋白含量；

圖3：不同超聲破碎條件下產生的P450酶含量。

具體實施方式

為了使本發明的目的及優勢更清新地展現，現將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發明進行解釋，并不用于限定本發明。

a.實驗前準備好一盆-80℃的冰，將需要的肝臟灌洗緩沖液和儲存緩沖液提前30min放置在冰上，同時在冰上放置幾個稱重的50mL離心管。