[發(fā)明專利]一種血管生成抑制劑多肽HS-1及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510901937.0
• 申請日: 2015-12-05
• 公開（公告）號: CN105418735A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李斯文;趙磊
• 申請（專利權(quán)）人: 李斯文
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/16;C07K1/06;G01N33/68;A61K38/10;A61P35/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種血管生成抑制劑多肽HS-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，癌癥已經(jīng)成為除心血管疾病之外的另一殺手，癌癥的治療方式主要以手術(shù)、化療和放療為主、但是化療藥物作用大多是不具有選擇性的，廣泛分布在體內(nèi)各個器官，治療劑量下對正常組織器官損害很大，雖然患者病情能得到暫時緩解，但是對于患者的生存質(zhì)量有著嚴(yán)重的危害，并且療效都不是很理想。因而開發(fā)具有腫瘤特異選擇性的化療藥物成為了研究熱點(diǎn)。

整合素受體(Integrin)為細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用，并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號傳導(dǎo)。整合素受體是由α和β亞基以非共價鍵結(jié)合而形成的跨膜異二聚體糖蛋白，屬于I型膜蛋白，迄今已發(fā)現(xiàn)由18種不同的α亞基和8種β亞基組成的24種整合素。

內(nèi)皮抑素是能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一類血管生成抑制劑。內(nèi)皮抑素是膠原XVIII的C-端片段，分子量為20kD_a，能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各種原發(fā)腫瘤。內(nèi)皮抑素能夠與整合素α5β1相互作用，預(yù)示著α5β1可能是endostatin的功能靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種血管生成抑制劑多肽HS-1，多肽HS-1對腫瘤細(xì)胞整合素受體具有特異選擇性，有良好的應(yīng)用前景，多肽HS-1由19個氨基酸組成，其序列為Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp，本發(fā)明的19肽是在內(nèi)皮抑素序列中的12肽序列Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro基礎(chǔ)上進(jìn)行的改造，Gly-Arg-Asp(GRD)是與整合素受體配體RGD功能相似的肽序列，同樣對腫瘤細(xì)胞有著特異選擇功能，所以將12肽與靶向GRD結(jié)合起來，使HS-1具有了靶向性同時增強(qiáng)了抗腫瘤活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種血管生成抑制劑多肽HS-1，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。

本發(fā)明的另一方面，血管生成抑制劑多肽HS-1在診斷、預(yù)防和治療腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一方面，血管生成抑制劑多肽HS-1的合成方法，包括以下步驟：

1)偶聯(lián)：先將芴甲氧羰酰基-天冬氨酸-rink氨基樹脂溶脹于DMF中，接著用piperdine/DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)基，用DMF洗滌脫帽子后的樹脂，加入原料Fmoc-Arg(tBU)-OH，縮合劑用HBTU；kaiser法檢偶聯(lián)反應(yīng)是否完成；重復(fù)上述操作，依次偶聯(lián)Fmoc-Gly(OtBU)-OH，...FmocGly--OH；Fmoc-Pro(Boc)-OH；Fmoc-Val(Boc)-OH………..Fmoc-Ser(Pbf)-OH，完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的peptidylresin，真空干燥箱里充分干燥；

2)樹脂與肽的分離裂解：

①裂解液的配制：裂解液的配比如下：

②裂解液配好后，混合均勻，放在冰箱里冷藏，然后將裂解液加入樹脂中磁力攪拌，然后，將裂解液與樹脂分離，棄去樹脂，保留濾液，將濾液緩慢滴加到冰無水乙醚中，滴加完畢后，自然沉降，然后在高速離心機(jī)里離心，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥箱中干燥，得到干粉粗品；

3)純化：

取上述干粉粗品，用0.1％TFA/H2O溶解。經(jīng)過濾后，上樣到C18制備柱，用HPLC進(jìn)行梯度洗脫，收集目標(biāo)肽的洗脫液體。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

1.本發(fā)明利用對整合素受體有特異親和力的GRD肽片段與血管生成抑制蛋白內(nèi)皮抑素的有效序列進(jìn)行連接，形成了一組全新的多肽藥物。

2.本發(fā)明通過多肽的固相合成得到HS-1。

3.產(chǎn)物在體內(nèi)外的腫瘤攝取實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了高效的腫瘤靶向能力，能夠被整合素高表達(dá)細(xì)胞系特異吸收，起到靶向治療的目的。

4.在體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)中，本產(chǎn)品對比血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素在抑制腫瘤生長過程中有顯著的提高，能夠作為實(shí)體腫瘤的特效藥物。

附圖說明

圖1是激光共聚焦實(shí)驗(yàn)觀察RhB-HS-1與單獨(dú)RhB對不同腫瘤細(xì)胞的攝取(A為U87MG細(xì)胞，B為MDA-MB-231細(xì)胞)