[發明專利]一種鴨黃病毒核酸液相芯片的檢測方法

有效

• 申請號: 201510901623.0
• 申請日: 2015-12-08
• 公開（公告）號: CN105331744B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 徐彪;鄭小龍;王群;孫明君;張曉文;孫濤;岳志芹
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6837;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種鴨黃病毒核酸液相芯片檢測方法，包括下列步驟：（1）設計引物探針（2）RT?PCR反應體系的建立（3）液相芯片檢測體系的建立。本發明的檢測方法具有高通量、檢測靈敏度高、重復性好等優點，結合RT?PCR技術，通過穩定性試驗、特異性試驗與靈敏度試驗，成功構建了液相芯片技術檢測鴨病毒的檢測平臺。

技術領域

本發明涉及一種鴨黃病毒核酸液相芯片的檢測方法。

背景技術

鴨黃病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群，和該群中的Tembusu病毒親緣關系最近。該病毒引起的傳染病于2010年5月在浙江、江蘇、福建等地發生感染，主要引起蛋鴨和種鴨產蛋量驟減，甚至停產，發病率達100％，死亡率約5％～10％。目前，華北、華中、華南和西南等地均有該病發生的報道，流行區域幾乎遍及我國主要水禽產區。據國家水禽產業技術體系2010年11月份調查顯示，該病造成的經濟損失已超過50億元。

目前疫病病原檢測主要以PCR和免疫學方法為主，但其不能滿足出入境等高通量檢疫的要求，且臨床中多種疫病的病原鑒別診斷要求快速、高靈敏的檢測技術。液相芯片技術是一種被用于臨床診斷的新型生物芯片，由Luminex公司于1995年研發，該技術是一項突破性的生物芯片分子檢測新技術，具有高通量、靈敏度高、重復性好、靈活性大的特點。液相芯片技術已通過FDA批準，應用于醫學臨床的高通量檢測，它在各種應用中的檢測結果與傳統的ELISA基本一致，但有著ELISA無法比擬的優越性。本研究利用液相芯片技術建立檢測鴨黃病毒核酸的方法,并評價了該檢測方法的敏感性和特異性，為鴨黃病毒性動脈炎的的檢測提供了一種高通量、敏感、特異、快速、高效的方法。

液相芯片技術是20世紀90年代中期發展起的一種集流式技術、熒光微球、激光、數字信號處理和傳統化學技術為一體的新型生物分子高通量多重檢測技術。它既可進行免疫學檢測也可進行核酸檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種鴨黃病毒核酸液相芯片檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

本發明提供的鴨黃病毒核酸液相芯片檢測方法，包括下列步驟：

(1)設計引物探針

(2)RT-PCR反應體系的建立

(3)液相芯片檢測體系的建立

所述的設計的引物探針序列如下：

Primer1：DYF:5’-AGAATCCAGATGCCCAACCA-3’；

Primer2：DYR:5’-Biotin-CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC-3’；

Probe：DYProbe:5’-NH₂(CH₂)₁₂-TCATAATCCCAAGGCAAC-3’；

RC-Probe：DY-RCProbe:5’-Biotin-GTTGCCTTGGGATTATGA-3’。

所述的RT-PCR反應體系的建立包括下列步驟：

采用RNA提取試劑盒進行RNA的提取；在0.2mL PCR反應管中，依次加入10×RT-PCRbuffer，2.5μL；dNTP(各2.5mmol/L)，2.0μL；10pmol/μL引物對，各1μL；Inhibiter 0.5μL；AMV XL 0.5μL；AMV Taq(5U/μL)，0.25μL；25mmol/L MgCl₂，5.0μL；RNA模板5.0μL；加入雙蒸水7.25μL；使反應體積達到25μL；