[發明專利]一種鴨黃病毒核酸液相芯片的檢測方法

有效

• 申請號: 201510901623.0
• 申請日: 2015-12-08
• 公開（公告）號: CN105331744B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 徐彪;鄭小龍;王群;孫明君;張曉文;孫濤;岳志芹
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6837;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.鴨黃病毒核酸液相芯片檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）設計引物探針；

（2）RT-PCR反應體系的建立；

（3）液相芯片檢測體系的建立；

設計的引物探針序列如下：

Primer1：DYF:5’-AGAATCCAGATGCCCAACCA-3’；

Primer2 ：DYR:5’-Biotin-CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC-3’；

Probe：DYProbe:5’-NH₂(CH₂)₁₂-TCATAATCCCAAGGCAAC-3’；

RC-Probe：DY-RCProbe:5’-Biotin-GTTGCCTTGGGATTATGA-3’；

所述的RT-PCR反應體系的建立包括下列步驟：

采用RNA提取試劑盒進行RNA的提取；在0.2 mL PCR反應管中，依次加入10×RT-PCRbuffer， 2.5μL；各2.5 mmol/L 的dNTP ，2.0μL；10 pmol/μL 引物對， 各1μL；Inhibiter0.5μL；AMV XL 0.5μL；5 U/μL的AMV TaqμL，0.25μL；25 mmol/L MgCl₂， 5.0μL；RNA 模板5.0μL；加入雙蒸水7.25μL；使反應體積達到25μL；

在PCR儀上進行RT-PCR擴增，優化并確定RT-PCR工作程序：50℃ 30min；94℃ 2min；然后94℃ 30sec、58℃ 30sec、72℃ 30sec，30個循環；最后72℃延伸5min，4℃保溫；

擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統上觀察、分析擴增產物；

所述的液相芯片檢測體系的建立，包括下列步驟：

（1）寡核苷酸探針與微球共價偶聯

①將微球漩渦混合20s充分分散；取75μL 的3×10⁶個微球，于1.5ml離心管中10000g離心1min，去上清；

②加入50μL pH4.5的 0.1mol/L甲基咪唑溶液，漩渦混合，超聲波處理0.5-1min；

③加入氨基化探針1.0nmol，漩渦混合；

④加入2.5μL碳二亞胺溶液充分混勻，室溫避光孵育30min；碳二亞胺溶液的配置方法是10mg的碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水；

重復④一次；

加入1.0ml 0.02% Tween-20，混勻，10000g離心1min，棄上清；

加入1.0ml 0.1% SDS，混勻，10000g離心1min，棄上清；

用pH4.5的0.1mol/L甲基咪唑溶液100μL 重懸微球，2-8℃避光保存，待用；

（2）雜交

雜交體系包括1.5μL探針偶聯微球，33μL 1.5×TMAC 雜交液，14.5μL TE，2.5μL RT-PCR產物；混合均勻后于98℃變性10min，孵育15min，18000g離心2min 去上清；加入50 μL用1×TMAC 雜交液稀釋500倍的并經過PE標記的鏈親合素，52下℃孵育10-15min，18000g離心2min 去上清；加入50 μL 1×TMAC 雜交液，漩渦混合使微球重懸，上機分析。