[發明專利]一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、嗜熱堿性果膠裂解酶及其應用

有效

• 申請號: 201510901096.3
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN105441467B
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 張作明;李海超;張靜;李正強;于擎
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 王淑秋;王恩遠

一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、嗜熱堿性果膠裂解酶及其應用，屬于生物工程技術領域。該工程菌的保藏編號為CGMCC No.11460，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2015年9月29日。本發明主要公開嗜熱堿性果膠裂解酶，最適反應溫度為70℃，最適Ca²⁺濃度為0.8mM，底物為0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸，pH 9.5。該酶在最適pH 9.5、Ca²⁺0.8mM、70℃時酶比活為900U/mg；在70℃保溫下，半衰期為6h；經過鎳柱純化處理后CbPelC可達到50mg/L(1L發酵液)。本發明所述嗜熱堿性果膠裂解酶的耐熱性和產量有大幅度挺高，更加適應現代工業生產要求，也為工業大規模生產堿性果膠酶提供了有效地方法。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、嗜熱堿性果膠裂解酶及該酶在降解果膠物質中的應用。

背景技術

果膠物質主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)組成，并且側鏈還常帶有海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，廣泛存在于植物初生細胞壁中。

果膠酶是一系列分解果膠物質的酶類的總稱，在高等植物和微生物中分布甚廣。植物在成熟過程中，果膠酶使植物細胞壁更松軟，對植物組織腐敗再生平衡也起到了重要作用。果膠酶按其作用方式的不同可分為兩大類，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分為水解酶和裂解酶。水解酶是通過引入水分子水解糖苷鍵，而裂解酶是通過反式消去作用斷裂糖苷鍵。

果膠裂解酶是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細胞壁并導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶，它在果膠降解過程中起著重要的作用。其作用機制是通過β-消旋的方式作用于斷裂糖苷鍵，形成不飽和雙鍵，產生不飽和的半乳糖醛酸寡聚糖。果膠裂解酶也是麻料脫膠工藝和紡織工藝中不可缺少的主要酶類。在醫藥、生物技術、飼料加工、環保方面也具有相當地位，在木材防腐和造紙等方面也應用廣泛。

目前果膠裂解酶主要以堿性酶為主，而且大多是常溫酶，嗜熱酶較少，迄今為止，關于嗜熱纖維素酶的報道很多，而關于嗜熱果膠酶的報道很少。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種Caldicellulosiruptor bescii基因來源的嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌以及構建方法，所述的嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌Escherichia coliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC，其保藏編號為CGMCC No.11460，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，保藏日期為2015年9月29日。

工程菌表達產物是細胞可溶性蛋白，通過細胞超聲破碎，加熱失活大腸桿菌雜蛋白，進行分離純化得到嗜熱蛋白，即嗜熱堿性果膠裂解酶。

本發明制備的嗜熱堿性果膠裂解酶的產量可達到50mg/L(1L發酵液)，相對現有國內篩選到的堿性果膠酶，是一種效價很高的堿性果膠酶，為進一步實現工業化鋪墊，也為工業大規模生產堿性果膠酶提供了有效地方法。

本發明所述的嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌以源于熱梭桿菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因為模板，設計引物，通過PCR反應擴增3’端含有6個組氨酸標簽的嗜熱堿性果膠裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，測序譜圖如圖1所示。將該嗜熱堿性果膠裂解酶基因PelC連接到表達載體pET20b(+)上獲得重組表達載體，將該重組表達載體轉化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中得到嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌。