[發明專利]一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、嗜熱堿性果膠裂解酶及其應用

有效

• 申請號: 201510901096.3
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN105441467B
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 張作明;李海超;張靜;李正強;于擎
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 王淑秋;王恩遠

1.一種嗜熱堿性果膠裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌，其特征在于：該工程菌的保藏編號為CGMCCNo.11460，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2015年9月29日。

3.權利要求2所述的一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌的構建方法，其步驟如下：

(1)以Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因組DNA為模板，設計引物，通過PCR反應擴增得到3’端含有6個組氨酸標簽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嗜熱堿性果膠裂解酶PelC基因；

(2)將步驟(1)得到的嗜熱堿性果膠裂解酶基因PelC酶切后與pET20b(+)表達載體連接，得到重組表達載體pET20b(+)-PelC；

(3)將重組表達載體pET20b(+)-pelC轉化到大腸桿菌表達宿主Escherichia coliBL21(DE3)中，構建得到嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌。

4.如權利要求3所述的一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌的構建方法，其特征在于：步驟(1)中所述的引物包括上游引物和下游引物，

上游引物5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，

下游引物5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'，

上游引物5'端CATATG為NdeⅠ酶切位點，保護堿基GGAATTC；下游引物5'端CTCGAG為XholⅠ酶切位點，保護堿基CCG。

5.一種嗜熱堿性果膠裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.權利要求5所述的嗜熱堿性果膠裂解酶的制備方法，其特征在于：是將權利要求2所述的嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌接種至裝有20mL種子培養基的50mL錐形瓶中，接種量2‰～5‰(v/v)，37℃、170r/min振蕩培養至OD₆₀₀＝6.0，獲得種子液；然后將種子液接種至含有50μg/mL氨芐的裝有2L發酵培養基的5L錐形瓶中，接菌量為2‰～5‰(v/v)，于37℃、170r/min振蕩培養至OD₆₀₀＝0.6時加入終濃度0.5mM IPTG進行誘導，同時將溫度調整為25～28℃，轉速調整為100～120r/min，誘導發酵18～24h，從而得到工程菌發酵液；再將細胞超聲破碎，加熱失活大腸桿菌雜蛋白，通過鎳柱親和層析法得到嗜熱堿性果膠裂解酶。

7.權利要求5所述嗜熱堿性果膠裂解酶在降解果膠物質中的應用。

8.如權利要求7所述嗜熱堿性果膠裂解酶在降解果膠物質中的應用，其特征在于：果膠物質為多聚半乳糖醛酸。