[發(fā)明專(zhuān)利]一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510895324.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105420150A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 霍貴成;徐敏;蒙月月
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;A23C9/127;A61K35/747;A61P1/14;C12R1/23
• 代理公司: 北京東正專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株具有高抗胃腸道脅迫的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

ExpertCommittee定義益生菌為“活的微生物，以一定數(shù)量攝入，能對(duì)健康產(chǎn)生益處，并且這種益處超越一般的固有營(yíng)養(yǎng)”，這表明：益生菌必須是活的，同時(shí)要以高數(shù)量存在，通常日攝入劑量為10⁹細(xì)胞量。益生菌的大部分菌株為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，因這些乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵乳制品有一段長(zhǎng)的記錄歷史，所以一直被沿用。

益生菌進(jìn)入機(jī)體，需要耐受胃腸道酸性環(huán)境及胃腸道膽鹽環(huán)境，所以如何耐受住胃酸、腸酸及膽汁，成為益生菌發(fā)揮作用的前提。因此，篩選出具有高抗胃腸道脅迫的乳酸菌是非常必要的。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文“抗胃腸道脅迫益生菌的篩選及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)”(田芬等)一文就抗胃腸道脅迫的益生菌進(jìn)行了篩選，并且利用細(xì)菌生態(tài)學(xué)、生理學(xué)和基因序列分析，篩選出性能較佳的5株益生菌作為研究對(duì)象，分別為嗜酸乳桿菌KLDSAD1和AD2，動(dòng)物雙歧桿菌KLDS2.0001、2.0002和2.0604，繼續(xù)后續(xù)的研究，并且得出嗜酸乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌都有很好的酸和膽汁鹽耐受性，動(dòng)物雙歧桿菌的耐酸性較強(qiáng)于嗜酸乳桿菌的耐酸性。

雖然研究得出的嗜酸乳桿菌KLDSAD1和AD2均具良好的胃酸耐受性，但是仍然不能達(dá)到高酸條件下的具有很好的胃腸道脅迫能力，因此，在此基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，進(jìn)一步篩選更高的抗胃腸道脅迫能力的乳桿菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是篩選出一種嗜酸乳桿菌CGMCC10436，其具有更高的胃腸道脅迫能力。

本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)這種嗜酸乳桿菌的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC10436，該菌株是從傳統(tǒng)乳制品中分離的乳酸菌中篩選出的，于2015年01月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏號(hào)為CGMCCNo.10436，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

具體的，所述的嗜酸乳桿菌來(lái)自于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟、海拉爾市及鄂爾多斯市等地區(qū)的牧民家中采集傳統(tǒng)方法制作的傳統(tǒng)稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的篩選。具體如下：

(1)將25g樣品在無(wú)菌條件下剪碎，溶于225mL無(wú)菌生理鹽水中，梯度稀釋后選擇合適的稀釋度，取1mL稀釋液加入無(wú)菌平皿，傾注于20mLMRS固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72h。

(2)選取菌落數(shù)量在15～150的平板，隨機(jī)選取符合乳酸菌菌落形態(tài)特征的菌落，從中挑取少量細(xì)菌，溶于于MRS液體培養(yǎng)基中，并進(jìn)行30℃培養(yǎng)48h。

(3)將分離到的菌株在MRS固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線(xiàn)進(jìn)行純化。

(4)將純化好的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。

(5)將所有革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、不形成芽孢的菌株(初步判斷為乳酸菌)選出來(lái)，在其培養(yǎng)液中加入甘油，使甘油的最終濃度為30％(v/v)，貯藏于-80℃待用。

(6)將上述分離到暫定為乳酸菌的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代后進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。

(7)以標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜酸乳桿菌作為對(duì)照菌株，進(jìn)行以下生理生化試驗(yàn)：H2S試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)、硝酸鹽降解試驗(yàn)及乙偶姻產(chǎn)生試驗(yàn)，選取與標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜酸乳桿菌生理生化試驗(yàn)相同的乳酸菌。

(8)提取菌株基因組DNA，進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，將本發(fā)明菌株的16SrDNA序列與NCBI嗜酸乳桿菌的序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定出，此菌株為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。

然后，將本發(fā)明嗜酸乳桿菌與嗜酸乳桿菌(嗜酸乳桿菌KLDSAD1、嗜酸乳桿菌酸乳桿菌KLDSAD2)進(jìn)行對(duì)比，研究此次篩選出的嗜酸乳桿菌的抗胃腸道脅迫能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究篩選出的嗜酸乳桿菌對(duì)酸液、腸液及人工膽鹽均具有較好的耐受力，并且效果明顯優(yōu)于嗜酸乳桿菌KLDSAD1、酸乳桿菌KLDSAD2。

所篩選出來(lái)的嗜酸乳桿菌具有高的抗胃腸道脅迫能力。