[發明專利]一種消化酶組合物及成纖維細胞和飼養層細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201510889246.3
• 申請日: 2015-12-04
• 公開（公告）號: CN105316309A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發明（設計）人: 陳海佳;葛嘯虎;王一飛;羅二梅;張維敏
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N9/64;C12N5/071;C12N5/073
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種消化酶組合物及成纖維細胞和飼養層細胞的制備方法。

背景技術

胚胎干細胞(embryonicstemcell，ESCs，簡稱ES、EK或ESC細胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內環境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。胚胎干細胞在組織工程與再生醫學等領域極具應用價值。

然而，由于其難以獲得且涉及敏感的倫理問題，使得研究一度陷入尷尬境地。2006年8月，日本Yamanaka研究小組向小鼠成纖維細胞內導入4種轉錄因子基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，成功地將其重編程為ESCs樣誘導性多能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。2007年底，日本Yamanaka小組和美國Thomson小組相繼將這一革命性技術在人類細胞中得以實現。iPSCs的研究是一項具有開創性治療性克隆的基礎研究，避開了長期以來ESCs難以獲取且極易引發倫理爭議的問題，為干細胞醫學應用開辟了一條新的途徑，被認為是干細胞領域乃至整個生物學領域的重大發現。包括英國愛丁堡大學IanWilmut教授在內的許多科學家均認為誘導性多能干細胞才是干細胞未來的研究方向。iPSCs細胞不僅對于干細胞研究具有重要的理論意義，而且在細胞治療、組織器官再生、藥物篩選與評價等領域極具應用價值。

現在的iPS技術較初始建立的iPS技術已成熟很多，但目前其距全能干細胞還有一定的差距，且iPS細胞的臨床應用研究僅限于理論或初步試驗方面。多能干細胞的潛能是巨大的，若能排除iPS細胞應用的安全隱患，提高iPS細胞的得率，進一步提高轉化率則可給更多重大疾病患者帶來福音。提高iPS細胞的得率，需要多方面條件的改善，正確選擇和優化iPS細胞的培養體系也是至關重要的。目前iPS細胞的培養主要分為以下兩種培養方式：無飼養層培養和有飼養層培養。現在市面上所售的無飼養層細胞培養基五花八門，然而iPS細胞在初期培養階段一般都需依賴于能分泌他們在體外存活增殖所必需的生長因子的飼養層細胞。飼養層細胞所分泌的生長因子是iPS細胞培養常用的生長增殖促進劑和分化抑制劑。

目前，制備iPS細胞飼養層細胞的方法是分離出小鼠胚胎，將小鼠胚胎消化成細胞并接種。具體為：采用斷頸法處死C57孕鼠，將小鼠放入75％的酒精中浸泡3-5分鐘，取出小鼠，放入無菌超凈臺中，用鑷子和剪刀依次剪開皮膚和內膜，暴露出內臟，找到胚胎，在35mm培養皿中洗滌3次，將胚胎用剪刀剪碎，用0.25％的胰蛋白酶消化15-20分鐘，用含胎牛血清的培養基終止消化，300-600g離心5-10分鐘；將得到的細胞沉淀用含8％～15％的胎牛血清的高糖DMEM培養基重懸，采用臺盼藍染色進行細胞計數，然后接種到細胞預先用0.1～0.5％的明膠溶液包被0.5～2小時的細胞培養瓶中，在37℃、5％CO₂培養箱中培養。然而，采用該方法獲得的飼養層細胞的得率較低。因此，建立一種高效的飼養層細胞的制備方法是iPS細胞培養的關鍵。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種消化酶組合物及成纖維細胞和飼養層細胞的制備方法。該消化酶組合物將胰蛋白酶和分散酶以一定比例聯合使用后，在大大減少消化酶用量的情況下，反而可起到更好的消化效果，成纖維細胞的得率更高。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種消化酶組合物，包括胰蛋白酶和分散酶。

胰蛋白酶(EC3.4.4.4)為蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

分散酶是一類中性金屬蛋白水解酶，與胰酶、膠原酶相比，它的作用更加溫和，所以不會損傷細胞。此外，分散酶也可以用于組織分離。

本發明研究發現，與單獨使用胰蛋白酶或分散酶相比，將胰蛋白酶和分散酶以一定比例聯合使用后，在大大減少消化酶用量的情況下，反而可起到更好的消化效果，成纖維細胞的得率更高。