[發明專利]一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201510884902.0
• 申請日: 2015-12-04
• 公開（公告）號: CN105412923A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 寧昆;劉佩紅;周錦萍;王建;張維誼;楊德全;齊新永;葛菲菲;李鑫
• 申請（專利權）人: 上海市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: A61K39/42
• 分類號: A61K39/42;A61K45/06;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/02;A61K35/741
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 林煒

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種獸醫生物制品，具體來說是一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備方法。

背景技術

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）所引起的豬的一種急性高度接觸性傳染病，各年齡段的豬均可發病，但對哺乳仔豬的危害最為嚴重。感染PEDV的仔豬常會因急性腸炎及致命性水瀉而導致脫水死亡，20日齡以內仔豬死亡率可達95%以上，給養豬業帶來巨大經濟損失。

疫苗接種是預防疾病發生的主要途徑之一，然而在此次國內的PED流行中，此方法并沒有有效遏制PED的發生與流行。卵黃抗體作為一種有較強免疫功能的蛋白質，目前已有報道將其用于豬某些腸道疾病的防治，效果較好。而且PEDV主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性，卵黃抗體經口服后在腸道內與PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感染，同時病毒排出體外后失去感染力，對該病流行也有一定的抑制作用。除此之外，卵黃抗體還是一種高產、優質的多克隆抗體，產量高，價格低廉，對腸道正常菌群無副作用，不存在抗藥性和藥物殘留問題。因此，發展特異、安全、高效的卵黃抗體口服制劑，具有重要的臨床和現實意義，應用前景廣闊。

目前為止，尚沒有以PEDV中和表位COE蛋白制備卵黃抗體的研究和應用的文獻報道。

S蛋白是PEDV的主要結構蛋白，在介導宿主產生中和抗體的過程中發揮著重要作用，如識別靶細胞、促進病毒和細胞膜的融合等，所以S蛋白被認為是有效抵抗PEDV的主要靶抗原。近年來，國內外許多學者對S蛋白進行了廣泛研究。Chang等根據TGEVS基因的中和表位序列，推測出了PEDVS基因的一個抗原表位區（499-638aa），并命名為COE，隨后也被很多研究人員用于基因工程疫苗的制備。Kang等已將PEDVBrl/87株的COE基因在煙草中表達，并通過動物試驗證實其具有良好的抗原性。BaeJL等人將COE基因轉入煙草中，給小鼠注射轉基因植物蛋白，結果證明煙草表達的該疫苗具有免疫原性。此外，在使用ELISA檢測PEDV抗體時，抗S蛋白的抗體較N蛋白抗體更容易被檢出，而且抗S蛋白抗體比抗N蛋白抗體更為持久。因此，S蛋白在PEDV新型疫苗研究以及PEDV血清學診斷方面具有重要意義。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備方法，所述的這種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備方法解決了現有技術中沒有很好的藥物治療仔豬流行性腹瀉的技術問題。

本發明提供了一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑，含有以PEDV流行毒株保護性抗原基因COE蛋白免疫非免疫產蛋雞后收集的雞蛋卵黃中提取的卵黃抗體。

進一步的，所述的一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑，由植物油、卵黃、山梨酸鉀、乙氧基喹啉、維生素、礦物質和益生菌，在所述的口服劑中，所述的植物油的質量百分比濃度為57%-60%，所述的的卵黃的質量百分比濃度為37%-40%，所述的山梨酸鉀的質量百分比濃度為0.25%，所述的乙氧基喹啉的質量百分比濃度為0.25%，余量為所述的維生素、礦物質和益生菌，所述的維生素、礦物質和益生菌的質量比為1:1:1，所述的卵黃是以PEDV流行毒株保護性抗原基因COE蛋白免疫非免疫產蛋雞后收集的雞蛋卵黃。

本發明還提供了上述的一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備方法，包括以下步驟：

1)采用豬流行性腹瀉病毒陽性病料，使用RT-PCR方法擴增保護性抗原基因COE，連接到原核表達載體，對COE蛋白進行表達、純化，使用弗氏佐劑對蛋白進行乳化，制備成免疫原；

2)利用制備的免疫原免疫非免疫蛋雞；

3)免疫后收集雞蛋，在無菌條件下收集卵黃，然后提取卵黃中的卵黃抗體；

4)運用蝕斑減數試驗測定卵黃抗體對PEDV病毒的中和抗體效價；

5)收集卵黃抗體效價在1:64以上的雞蛋，用75%酒精浸泡消毒20min-30min，晾干，打開雞蛋，分離蛋黃，將蛋黃制備成卵黃抗體口服劑。