[發(fā)明專(zhuān)利]一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510872810.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105330745A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘麗金;黃島平;潘紅;林葵;陳珊蝶;黎穎;寧歡歡;徐慧;陳建紅;蕭浩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司;廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/44
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/44
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 王正茂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)

蘇丹紅學(xué)名蘇丹(Sudan)，共分為蘇丹紅I、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ。蘇丹紅為親脂性偶氮染料，主要用于油彩、機(jī)油、蠟和鞋油等產(chǎn)品的染色。由于用蘇丹紅染色后的食品顏色非常鮮艷且不易褪色，能引起人們強(qiáng)烈的食欲，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅添加到食品中。常見(jiàn)的添加蘇丹紅的食品有辣椒粉、辣椒油、紅豆腐，紅心禽蛋等。

由于蘇丹紅是一種人工合成的一種工業(yè)染料，1995年歐盟(EU)等國(guó)家已禁止其作為色素在食品中進(jìn)行添加，對(duì)此我國(guó)也明文禁止。但由于其染色鮮艷，印度等一些國(guó)家在加工辣椒粉的過(guò)程中還容許添加蘇丹紅I。EU對(duì)從印度進(jìn)口的紅辣椒粉中檢出蘇丹紅，其檢出蘇丹紅I的量為2.8-3500mg/kg。同時(shí)在一些其它食品中也檢測(cè)到這種物質(zhì)，如一些調(diào)味品中蘇丹紅I的含量達(dá)到0.7-170mg/kg。也有一些報(bào)道稱(chēng)，在辣椒粉中還可檢測(cè)到蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，如在辣椒粉和辣椒醬中檢出蘇丹紅IV的含量分別為230和380mg/kg，但辣椒粉中一般多以檢出蘇丹紅I為主。英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局(TheFoodStandardAgency，F(xiàn)SA)就含有添加蘇丹紅色素的食品向消費(fèi)者發(fā)出警告，并在其網(wǎng)站上公布了可能含有蘇丹紅I的產(chǎn)品清單。截至2月24日，清單上的產(chǎn)品增加到了474種，包括香腸、泡面、熟肉、餡餅、辣椒粉、調(diào)味醬等產(chǎn)品。

歐洲調(diào)味品協(xié)會(huì)專(zhuān)家委員會(huì)(theExpertCommitteeonFlavouringsoftheCouncilofEurope)的資料信息顯示，歐洲每天紅辣椒粉的人均消費(fèi)量為50-500mg，而紅辣椒粉中蘇丹紅I的檢出量為2.8-3500mg/kg，從而推算歐洲人每天蘇丹紅I的人均可能攝入量為0.14-1750μg。而在法國(guó)向歐洲調(diào)味品協(xié)會(huì)專(zhuān)家委員會(huì)提交的一份報(bào)告中指出，人均每天辣椒(包括紅辣椒和辣椒粉)的消費(fèi)量和最大消費(fèi)量分別為77和264mg，按辣椒粉中蘇丹紅I的檢出量2.8-3500mg/kg進(jìn)行推算，則歐洲人每天人均蘇丹紅I的攝入量為0.2-270μg，最大攝入量為0.7-924μg。

鑒于蘇丹紅Ⅱ給人類(lèi)帶來(lái)健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快捷制備用于檢測(cè)蘇丹紅Ⅱ的多克隆抗體顯得尤為重要。

公開(kāi)于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

(1)將制備好的全抗原注射到免疫動(dòng)物體內(nèi)；

(2)再加強(qiáng)免疫3次后采血，檢測(cè)血清效價(jià)；

(3)若血清效價(jià)達(dá)到要求，則大量采血，離心取上清，得到抗血清；

(4)將所得抗血清流過(guò)抗原免疫親和填料，抗血清中的抗蘇丹紅Ⅱ抗體與偶聯(lián)在抗原免疫親和填料上的活性蘇丹紅Ⅱ特異吸附，洗掉雜質(zhì)，用弱酸洗脫，即得到抗蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體。

作為優(yōu)選，步驟(1)中所述的全抗原包括蘇丹紅Ⅱ-KLH和蘇丹紅Ⅱ-BSA。

作為優(yōu)選，所述的全抗原，其制備方法包括以下步驟：

(1)先用十二烷基硫酸鈉分別變性鑰孔血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白；

(2)再分別用熱的二硫蘇糖醇對(duì)變性后的鑰孔血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白進(jìn)行還原，然后分別用葡聚糖凝膠脫鹽后，得到巰基化的鑰孔血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白；

(3)分別再用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH＝8.5，然后滴入已制備好的3/8體積的活性蘇丹紅Ⅱ組分與鑰孔血藍(lán)蛋白，室溫反應(yīng)1h，再經(jīng)葡聚糖凝膠脫鹽后，即制得蘇丹紅Ⅱ-KLH全抗原，已制備好的1/8體積的活性蘇丹紅Ⅱ組分與牛血清蛋白同樣操作反應(yīng)即制得蘇丹紅Ⅱ-BSA全抗原。

作為優(yōu)選，所述的全抗原蘇丹紅Ⅱ-KLH做注射用；所述的全抗原蘇丹紅Ⅱ-BSA做檢測(cè)包被用。

作為優(yōu)選，所述的活性蘇丹紅Ⅱ組分，其制備方法包括以下步驟：

(1)將蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品溶解于無(wú)水氯仿中，在無(wú)水氯化鋁的作用下與溴乙酰氯反應(yīng)，得到具有活性的溴乙酰氯蘇丹紅Ⅱ混合物；

(2)將得到具有活性的溴乙酰氯蘇丹紅Ⅱ混合物用制備型高效液相反向柱色譜分離純化，收集具有蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品紫外光吸收光譜特征的活性蘇丹紅Ⅱ組分；

(3)將所收集的活性蘇丹紅Ⅱ組分重新萃取到氯仿中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再用丙酮復(fù)溶后備用。