[發(fā)明專利]一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510872810.0 | 申請日： | 2015-12-02 |
| 公開（公告）號： | CN105330745A | 公開（公告）日： | 2016-02-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 潘麗金;黃島平;潘紅;林葵;陳珊蝶;黎穎;寧歡歡;徐慧;陳建紅;蕭浩 | 申請（專利權(quán)）人： | 南寧市藍光生物技術(shù)有限公司;廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心 |
| 主分類號： | C07K16/44 | 分類號： | C07K16/44 |
| 代理公司： | 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279 | 代理人： | 王正茂 |
| 地址： | 530007 廣西壯族自治區(qū)南寧*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 蘇丹 克隆 抗體 制備 方法 | ||
1.一種蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將制備好的全抗原注射到免疫動物體內(nèi)；
(2)再加強免疫3次后采血，檢測血清效價；
(3)若血清效價達到要求，則大量采血，離心取上清，得到抗血清；
(4)將所得抗血清流過抗原免疫親和填料，抗血清中的抗蘇丹紅Ⅱ抗體與偶聯(lián)在抗原免疫親和填料上的活性蘇丹紅Ⅱ特異吸附，洗掉雜質(zhì)，用弱酸洗脫，即得到抗蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的全抗原包括蘇丹紅Ⅱ-KLH和蘇丹紅Ⅱ-BSA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的全抗原，其制備方法包括以下步驟：
(1)先用十二烷基硫酸鈉分別變性鑰孔血藍蛋白或牛血清蛋白；
(2)再分別用熱的二硫蘇糖醇對變性后的鑰孔血藍蛋白或牛血清蛋白進行還原，然后分別用葡聚糖凝膠脫鹽后，得到巰基化的鑰孔血藍蛋白或牛血清蛋白；
(3)分別再用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH＝8.5，然后滴入已制備好的3/8體積的活性蘇丹紅Ⅱ組分與鑰孔血藍蛋白，室溫反應(yīng)1h，再經(jīng)葡聚糖凝膠脫鹽后，即制得蘇丹紅Ⅱ-KLH全抗原，已制備好的1/8體積的活性蘇丹紅Ⅱ組分與牛血清蛋白同樣操作反應(yīng)即制得蘇丹紅Ⅱ-BSA全抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的全抗原蘇丹紅Ⅱ-KLH做注射用；所述的全抗原蘇丹紅Ⅱ-BSA做檢測包被用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的活性蘇丹紅Ⅱ組分，其制備方法包括以下步驟：
(1)將蘇丹紅Ⅱ標準品溶解于無水氯仿中，在無水氯化鋁的作用下與溴乙酰氯反應(yīng)，得到具有活性的溴乙酰氯蘇丹紅Ⅱ混合物；
(2)將得到具有活性的溴乙酰氯蘇丹紅Ⅱ混合物用制備型高效液相反向柱色譜分離純化，收集具有蘇丹紅Ⅱ標準品紫外光吸收光譜特征的活性蘇丹紅Ⅱ組分；
(3)將所收集的活性蘇丹紅Ⅱ組分重新萃取到氯仿中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再用丙酮復溶后備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的活性蘇丹紅Ⅱ組分按體積分為2等份，一份用于制備全抗原，另一份用于制備抗原免疫親和填料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的免疫動物為新西蘭大白兔。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇丹紅Ⅱ多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的抗原免疫親和填料的制備方法包括以下步驟：
(1)取2g賴氨酸溶于10mL0.1mol/L碳酸鈉，充分溶解后加入到25mL過碘酸鈉氧化的瓊脂糖填料中混勻，60℃反應(yīng)5min，搖勻再次反應(yīng)10min，轉(zhuǎn)4℃靜置20min，然后加入硼氫化鈉100mg混勻還原，室溫搖床上搖動過夜，得到賴氨酸瓊脂糖填料；
(2)將25mL的賴氨酸瓊脂糖填料轉(zhuǎn)移到50mL潔凈的空柱子，用500mL蒸餾水漂洗；
(3)先用50mL50％的冷丙酮洗1次，當溶液即將完全進入賴氨酸瓊脂糖填料層時，再加入50mL75％的冷丙酮洗1次，當溶液即將完全進入賴氨酸瓊脂糖填料層時，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即將完全進入賴氨酸瓊脂糖填料層時，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，當溶液還剩1/3在賴氨酸瓊脂糖填料層上時，反復震蕩重懸瓊脂糖珠，即得到重懸好的賴氨酸瓊脂糖填料；
(4)取現(xiàn)配的150mgNHS-碘乙酸活性酯，邊振蕩邊加入至步驟(3)得到的重懸好的賴氨酸瓊脂糖填料，蓋緊，室溫避光反應(yīng)60min；
(5)去除賴氨酸瓊脂糖填料中的液體，再用100mL100％丙酮洗1次，當溶液即將完全進入瓊脂糖珠層時，用含有0.1mol/LHCL的50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即將完全進入瓊脂糖珠層時，用含有0.1mol/LHCL的50mL50％的冷丙酮洗1次，當溶液還剩1/3在瓊脂糖填料層上時，反復震蕩重懸瓊脂糖珠；
(6)然后加入200mg的二硫蘇糖醇，即得到巰基化瓊脂糖填料；
(7)取1/2體積的活性蘇丹紅Ⅱ組分加入100uL飽和碳酸鈉，然后和懸浮在丙酮的巰基瓊脂糖珠填料室溫反應(yīng)過夜；
(8)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐溫20的磷酸緩沖液PBSt清洗，即得到的抗原免疫親和填料。
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