[發(fā)明專(zhuān)利]一種雞GM-CSF蛋白及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510870603.1
• 申請(qǐng)日: 2015-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105349578A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任廣彩;黃妙容;陳瑞愛(ài);劉傳高;黃文科
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/866
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/866;C12N15/27;A61K39/39;A61K39/12;A61P33/14
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 胡擁軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雞GM-CSF蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞因子是一類(lèi)由活性細(xì)胞分泌的可溶性的多肽或蛋白，通過(guò)與細(xì)胞表面的受體相互作用發(fā)揮特殊的生物活性。細(xì)胞因子具有明顯的免疫佐劑效應(yīng)，可增強(qiáng)病毒疫苗、細(xì)菌疫苗和寄生蟲(chóng)疫苗的保護(hù)效應(yīng)。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等在某些抗原和細(xì)胞因子作用下刺激產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的一類(lèi)細(xì)胞因子。GM-CSF不僅能刺激造血細(xì)胞增殖、分化和成熟，并從骨髓向外周轉(zhuǎn)移,而且還能活化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、及其他單核細(xì)胞,在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位,在免疫反應(yīng)中具有重要作用。GM-CSF通過(guò)促進(jìn)包括樹(shù)突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞的增殖分化,將其吸引到注射部位,增強(qiáng)抗原遞呈能力,從而達(dá)到增強(qiáng)免疫效果的作用。因此GM-CSF作為免疫佐劑具有很廣闊的發(fā)展前景。

Dranoff等首次將GM-CSF作為免疫佐劑，增強(qiáng)了抗腫瘤疫苗的免疫反應(yīng)，因而被大量用作DNA疫苗的免疫佐劑，以克服DNA疫苗免疫原性差的缺陷。2004年，Avery等從雞cDNA文庫(kù)中篩選到與人GM-CSF同源的雞GM-CSFcDNA。2008年譚兵克隆了四川山地烏骨雞的GM-CSF基因，并用大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)了該蛋白。2011年劉賀山也利用大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)了GM-CSF基因。而利用昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)制備雞GM-CSF蛋白的相關(guān)基礎(chǔ)研究,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有突出的優(yōu)點(diǎn)，例如：表達(dá)水平高、易于放大、生產(chǎn)的蛋白帶有適當(dāng)?shù)姆g后修飾，而且細(xì)胞生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單。因此較細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等更具潛在的發(fā)展優(yōu)勢(shì)。

雞傳染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)侵害引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雛雞和青年雞的法氏囊。該病不僅造成雞只死亡還導(dǎo)致免疫抑制，是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。隨著變異株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，傳統(tǒng)疫苗的研制速度已經(jīng)難于跟上該病的變化。單一抗原VP2的基因工程疫苗預(yù)防雞傳染性法氏囊病雖然效果不錯(cuò)，但是也存在免疫反應(yīng)不夠強(qiáng)，免疫原性弱、保護(hù)力相對(duì)不夠高等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白表達(dá)水平高、易于放大、利于大規(guī)模生產(chǎn)需要的雞GM-CSF蛋白的制備方法，本發(fā)明還提供該方法制得的雞GM-CSF蛋白以及該蛋白的應(yīng)用。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種雞GM-CSF蛋白的制備方法，包括如下步驟：

a.合成優(yōu)化的編碼雞GM-CSF蛋白的核苷酸序列，所述優(yōu)化的編碼雞GM-CSF蛋白的核苷酸序列如序列SEQIDNo:1所示；

b.利用SEQIDNo:1所示序列構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為：pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF；

c.將經(jīng)過(guò)b步驟得到的表達(dá)載體進(jìn)行病毒包裝，得到病毒原種；

d.將經(jīng)過(guò)c步驟得到的病毒原種進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)(通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)，可以提高病毒滴度)，然后收集擴(kuò)增后的培養(yǎng)基上清液并用收集到的上清液感染對(duì)數(shù)期的sf9細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染后的sf9細(xì)胞24-72h，收集培養(yǎng)基中的上清，經(jīng)離心、層析處理，，得到雞GM-CSF蛋白。

本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟中合成SEQIDNo:1所示序列具體為：以昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子對(duì)編碼雞GM-CSF蛋白的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，即得；所述編碼雞GM-CSF蛋白為GeneBank公布的編號(hào)為NO：EU939770的序列。

本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟中SEQIDNo:1所示序列通過(guò)化學(xué)法合成。

本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述b步驟中利用SEQIDNo:1所示序列構(gòu)建表達(dá)載體包括如下步驟：

1)將SEQIDNo:1序列克隆到pUC57載體質(zhì)粒上，得到pUC57-GM-CSF載體質(zhì)粒；

2)將pUC57-GM-CSF載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增中所采用的引物對(duì)為：

上游引物1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCGCTCAGCTCACTATCCTCCT-3’；

上游引物2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCG-3’；