[發明專利]一種雞GM-CSF蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510870603.1
• 申請日: 2015-11-30
• 公開（公告）號: CN105349578A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 任廣彩;黃妙容;陳瑞愛;劉傳高;黃文科
• 申請（專利權）人: 肇慶大華農生物藥品有限公司;廣東溫氏大華農生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/27;A61K39/39;A61K39/12;A61P33/14
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 胡擁軍

1.一種雞GM-CSF蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

a.合成優化的編碼雞GM-CSF蛋白的核苷酸序列，所述優化的編碼雞GM-CSF蛋白的核苷酸序列如序列SEQIDNo:1所示；

b.利用SEQIDNo:1所示序列構建表達載體，所述表達載體為：pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF；

c.將經過b步驟得到的表達載體進行病毒包裝，得到病毒原種；

d.將經過c步驟得到的病毒原種進行擴增培養，然后收集擴增后的培養基上清液并用收集到的上清液感染對數期的sf9細胞，然后在培養基中培養感染后的sf9細胞24-72h，收集培養基中的上清，經離心、層析處理，得到雞GM-CSF蛋白。

2.根據權利要求1所述的雞GM-CSF蛋白的制備方法，其特征在于所述a步驟中合成SEQIDNo:1所示序列具體為：以昆蟲細胞偏愛密碼子對編碼雞GM-CSF蛋白的基因序列進行密碼子優化，即得；所述編碼雞GM-CSF蛋白為GeneBank公布的編號為NO：EU939770的序列。

3.根據權利要求1所述的雞GM-CSF蛋白的制備方法，其特征在于：所述a步驟中SEQIDNo:1所示序列通過化學法合成。

4.根據權利要求1所述的雞GM-CSF蛋白的制備方法，其特征在于所述b步驟中利用SEQIDNo:1所示序列構建表達載體包括如下步驟：

1)將SEQIDNo:1序列克隆到pUC57載體質粒上，得到pUC57-GM-CSF載體質粒；

2)將pUC57-GM-CSF載體質粒進行PCR擴增，其中PCR擴增中所采用的引物對為：

上游引物1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCGCTCAGCTCACTATCCTCCT-3’；

上游引物2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCG-3’；

下游引物：5‘-CCCAAGCTTTTAGATGCAATCTTTTTCTTCGGGC-3’；

先用上游引物1和下游引物對模板pUC57-GM-CSF載體質粒進行第一次PCR擴增，再用上游引物2和下游引物對第一次PCR擴增的產物進行第二次PCR擴增，所述第一次擴增與第二次擴增采用相同的PCR反應體系和擴增反應程序：

PCR擴增中每50μLPCR反應體系包括：5×Fastpfubuffer10μL，dNTPMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)2μL，反向引物(10μM)2μL，Fastpfupolymerase1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O30μL；

PCR擴增反應程序為：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，30個循環；72℃5min；

3)將步驟2)中擴增后的產物用電泳回收大小為471bp的條帶，得到目的基因；其中，電泳回收所用到的膠床為瓊脂糖凝膠；

4)將pFastBac1質粒及步驟3)中收集到的目的基因進行雙酶切：

酶切反應在37℃水浴反應2h；

pFastBac1質粒酶切體系如下：質粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；

目的基因酶切體系如下：PCR回收產物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl；

然后，分別回收質粒pFastBac1酶切大片段和目的基因酶切產物；

5)將步驟4回收到的質粒pFastBac1酶切大片段和目的基因酶切產物連接，連接反應在22℃反應2小時，得到連接產物；連接反應體系如下：目的基因酶切產物6μl，pFastBac1酶切大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；

6)將步驟5)得到的連接產物與100μlJM109感受態細菌混勻后冰浴30min，42℃熱激45s，立即置冰上放置2min,加入預熱至室溫的400μlLB培養基，37℃恒溫搖床培養1h，4000rpm離心1min，棄去400μl培養上清，剩余100μl用移液器混勻后均勻涂布于含100μg/mlAmpicillin抗性的LB平板上，37℃恒溫培養箱倒置培養過夜；

7)在步驟6)的在37℃恒溫培養箱倒置培養過夜后的培養基中挑取1個單菌落接種于含5ml，100μg/mlAmpicillin抗性的LB培養液中，250rpm，37℃恒溫搖床培養過夜，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，利用質粒BamHI+HindIII進行雙酶切鑒定，然后將鑒定正確的重組克隆進行測序驗證；接著，挑選正確的pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF載體質粒進行克隆，備用。