[發明專利]一種漢坦病毒擴增方法

在審

• 申請號: 201510868348.7
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105368792A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發明（設計）人: 邵華
• 申請（專利權）人: 邵華
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及病毒培養技術領域，進一步涉及疫苗抗原制備技術領域，具體涉及一種漢坦病毒擴增方法。

背景技術

漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節段的負鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S3個片段，分別編碼L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。漢坦病毒具有極強的傳染性，人感染后可能導致死亡。對于漢坦病毒感染病例，臨床上主要是對癥治療配合高免血清和單克隆抗體治療，從療效、成本等方面考慮都不盡理想，綜合來看通過疫苗免疫是應對該病毒的根本措施。這就涉及到漢坦病毒抗原的擴增技術。

現有技術中漢坦病毒抗原生產主要采用細胞轉瓶培養方法，轉瓶工藝生產抗原病毒含量較低，僅為10^4.5～6.0TCID₅₀/ml，不能提供穩定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量應≥10^7.0TCID₅₀/ml)，需要進行高倍濃縮，且轉瓶工藝勞動強度大，生產一批需要100～200個轉瓶，需多人同時進行長時間的消化傳代操作，增加污染風險；生產周期長，需要20天；效率較低，每次培養只能收獲一次；生產成本較高，人工、場地及原料費用大；對環境要求較高，需要較大的場地和GMP廠房；不同生產批次及同一生產批次的轉瓶之間存在較大差異，容易造成批內及批間的抗原質量差異，進而影響病毒抗原質量的穩定性；轉瓶清洗需要大量水，并且產生的含毒廢水需要專門處理，容易對環境造成污染，如處理不當會造成生物安全和公共衛生問題。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種漢坦病毒擴增方法，以解決現有技術中存在的培養效率較低的技術問題。

本發明解決的另一技術問題是現有技術的漢坦病毒擴增方法質量不穩定。

本發明解決的再一技術問題是現有技術的漢坦病毒擴增方法產量較低。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種漢坦病毒擴增方法，該方法以COS-1細胞作為宿主細胞擴增漢坦病毒，同時以激流式生物反應器作為細胞培養裝置。

優選地，該方法是先以激流式生物反應器培養COS-1細胞，而后再向細胞培養液中接種漢坦病毒，擴增漢坦病毒。

優選地，所述培養COS-1細胞，是在激流式生物反應器中采用微載體懸浮培養的方式培養COS-1細胞。

優選地，該方法包括以下步驟：

1)向激流式生物反應器中加入細胞培養液，以(0.1～1)×10⁶個細胞/mL培養液的比例接種COS-1細胞培養，所述反應器中具有微載體；

2)當細胞密度達到(1～10)×10⁶個細胞/mL培養液時以0.01～0.03MOI的接種量向培養液中接入漢坦病毒，繼續培養細胞；

3)取培養液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。

優選地，步驟1)中細胞培養液的加入量為激流式生物反應器最大裝液量的1/2～3/4。

優選地，步驟1)中用于接種的COS-1細胞，是經EDTA-胰酶細胞分散液消化得到COS-1細胞懸液。

優選地，步驟2)中當細胞密度達到(1～10)×10⁶個細胞/mL培養液時，繼續培養細胞4～6h，而后以0.01～0.03MOI的接種量向培養液中接入漢坦病毒，再繼續培養細胞。

優選地，步驟3)中當微載體上細胞全部脫落后，取培養液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。

優選地，所述細胞培養液包括以下成分：85～90％(w/w)的DMEM液，青霉素鈉80～120單位/ml，鏈霉素80～120單位/ml，余量為牛血清；所述培養基pH為7～7.8。

優選地，步驟1)中對細胞的培養或步驟2)中接種漢坦病毒后對細胞的培養，滿足以下培養條件：培養溫度35～39℃，培養液pH7～7.8，培養液溶氧45～55％，攪拌速度50～70rpm。