[發(fā)明專利]一種漢坦病毒擴增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510868348.7
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105368792A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵華
• 申請（專利權(quán)）人: 邵華
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，進一步涉及疫苗抗原制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種漢坦病毒擴增方法。

背景技術(shù)

漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S3個片段，分別編碼L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。漢坦病毒具有極強的傳染性，人感染后可能導(dǎo)致死亡。對于漢坦病毒感染病例，臨床上主要是對癥治療配合高免血清和單克隆抗體治療，從療效、成本等方面考慮都不盡理想，綜合來看通過疫苗免疫是應(yīng)對該病毒的根本措施。這就涉及到漢坦病毒抗原的擴增技術(shù)。

現(xiàn)有技術(shù)中漢坦病毒抗原生產(chǎn)主要采用細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)抗原病毒含量較低，僅為10^4.5～6.0TCID₅₀/ml，不能提供穩(wěn)定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量應(yīng)≥10^7.0TCID₅₀/ml)，需要進行高倍濃縮，且轉(zhuǎn)瓶工藝勞動強度大，生產(chǎn)一批需要100～200個轉(zhuǎn)瓶，需多人同時進行長時間的消化傳代操作，增加污染風險；生產(chǎn)周期長，需要20天；效率較低，每次培養(yǎng)只能收獲一次；生產(chǎn)成本較高，人工、場地及原料費用大；對環(huán)境要求較高，需要較大的場地和GMP廠房；不同生產(chǎn)批次及同一生產(chǎn)批次的轉(zhuǎn)瓶之間存在較大差異，容易造成批內(nèi)及批間的抗原質(zhì)量差異，進而影響病毒抗原質(zhì)量的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)瓶清洗需要大量水，并且產(chǎn)生的含毒廢水需要專門處理，容易對環(huán)境造成污染，如處理不當會造成生物安全和公共衛(wèi)生問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種漢坦病毒擴增方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的培養(yǎng)效率較低的技術(shù)問題。

本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的漢坦病毒擴增方法質(zhì)量不穩(wěn)定。

本發(fā)明解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的漢坦病毒擴增方法產(chǎn)量較低。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種漢坦病毒擴增方法，該方法以COS-1細胞作為宿主細胞擴增漢坦病毒，同時以激流式生物反應(yīng)器作為細胞培養(yǎng)裝置。

優(yōu)選地，該方法是先以激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)COS-1細胞，而后再向細胞培養(yǎng)液中接種漢坦病毒，擴增漢坦病毒。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)COS-1細胞，是在激流式生物反應(yīng)器中采用微載體懸浮培養(yǎng)的方式培養(yǎng)COS-1細胞。

優(yōu)選地，該方法包括以下步驟：

1)向激流式生物反應(yīng)器中加入細胞培養(yǎng)液，以(0.1～1)×10⁶個細胞/mL培養(yǎng)液的比例接種COS-1細胞培養(yǎng)，所述反應(yīng)器中具有微載體；

2)當細胞密度達到(1～10)×10⁶個細胞/mL培養(yǎng)液時以0.01～0.03MOI的接種量向培養(yǎng)液中接入漢坦病毒，繼續(xù)培養(yǎng)細胞；

3)取培養(yǎng)液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。

優(yōu)選地，步驟1)中細胞培養(yǎng)液的加入量為激流式生物反應(yīng)器最大裝液量的1/2～3/4。

優(yōu)選地，步驟1)中用于接種的COS-1細胞，是經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化得到COS-1細胞懸液。

優(yōu)選地，步驟2)中當細胞密度達到(1～10)×10⁶個細胞/mL培養(yǎng)液時，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4～6h，而后以0.01～0.03MOI的接種量向培養(yǎng)液中接入漢坦病毒，再繼續(xù)培養(yǎng)細胞。

優(yōu)選地，步驟3)中當微載體上細胞全部脫落后，取培養(yǎng)液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。

優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)液包括以下成分：85～90％(w/w)的DMEM液，青霉素鈉80～120單位/ml，鏈霉素80～120單位/ml，余量為牛血清；所述培養(yǎng)基pH為7～7.8。

優(yōu)選地，步驟1)中對細胞的培養(yǎng)或步驟2)中接種漢坦病毒后對細胞的培養(yǎng)，滿足以下培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度35～39℃，培養(yǎng)液pH7～7.8，培養(yǎng)液溶氧45～55％，攪拌速度50～70rpm。