[發明專利]程序降溫法和玻璃化法相結合超低溫保存枇杷屬植物種質的方法

在審

• 申請號: 201510854698.8
• 申請日: 2015-11-30
• 公開（公告）號: CN105475133A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 林順權;劉義存
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及植物種質低溫保存技術領域，更具體地，涉及一種程序降溫法和玻璃化法相結合超低溫保存枇杷屬植物種質的方法。

背景技術

植物種質資源是人類所擁有的最寶貴的自然資源。

上個世紀60年代以來，許多國家對植物種質資源的收集和保存工作都加大了投入和研究力度，特別是經濟體發達的國家已建立了比較完善的田間基因庫。不足的是，田間種質保存占地廣，會耗費大量的人力、物力和財力，也容易受各種自然災害的影響，從而迫使人們探索更實用、安全、經濟的保存方法。直到上世紀中葉，植物離體培養技術開始出現并不斷完善和發展之后。有學者首次提出離體保存植物種質資源的策略（Henshaw，1975）。離體保存從而開始頻繁的出現在各種植物種質資保存的報道中，它以無菌培養條下，占用空間、勞動力和維持開大大減小，同時方便于世界之間交流等特點優點，從而得到了各國的重視（鐘蘭，2009）。

枇杷屬（EriobotryaLindl.）植物屬于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）。我國是枇杷種質資源最豐富的國家，原產我國的枇杷屬植物約有16個種（21個種類），主要分布于長江流域及長江以南各省（林順權等，2004）；此外，東南亞原產的枇杷屬植物約有6個種（11個種類），主要分布在老撾、越南、緬甸、菲律賓、柬埔寨等地（楊向暉等，2005）。

枇杷屬植物的種質資源保存方面，栽培枇杷的品種資源已在國家種質資源圃（福州）進行了很好的種植保存（鄭少泉，2006），栽培枇杷的離體保存方面也進行了一些研究（劉月學等，2004；王家福等，2004，2006；Wangetal.2007），只是尚未能廣泛應用。枇杷屬只有一個栽培種，即普通枇杷（EriobotryajaponicaLindl.），其余的約30個種的種質資源保存很少研究，種植保存方面僅胡又厘等（Huetal.2007）報道保存了10多個種；鑒于野生枇杷的材料的取得比栽培枇杷更為困難，而且遠離人們的關注視線，其種質資源保存的迫切性更甚，更有必要進行離體保存的研究，相關報道很少。

枇杷屬植物離體保存種質資源目前有研究主要是緩慢生長法。緩慢生長法是通過調節培養條件，抑制保存材料的生長和減少營養消耗來延長繼代時間、減少操作和勞力的保存方法（劉月學等，2004；王家福等，2004，2006）。減緩保存材料生長的具體方法如下：

主要方法是通過調整培養基配方，如降低培養基內營養水平；在培養基中添加化學物質如多效唑等抑制生長的方式（王家福，2002）；其次，還有脫水處理和復合限制生長措施減緩保存材料的生長（劉月學，2004）。雖然運用組織培養技術保存種質已取得了很好的效果，但是保存即使為1～3年后仍然要再繼代，致體細胞無性系變異的老問題還是可能會發生，從而使保存的原始種質丟失。

果樹超低溫保存自2000年以來，已進行了若干研究，例如：巴旦杏(Channuntapipatetal.2000)，柑橘（王子成等，2001），圓金柑（Choetal.2002），柿子（艾鵬飛等，2003），芒果（Wuetal.2003)，歐洲板栗（Corredoiraetal.2004），中華獼猴桃（Xuetal.2006），番木瓜（曾繼吾等，2005；Ashmoreetal.2007），歐李（張成婉等，2007）；還有趙艷華等先后也進行了多種果樹種質的超低溫保存研究，包括櫻桃（1999）、葡萄（2001）、梨（2004）、桃（2006）和李（2008）。但大部分果樹的超低保存技術并不成熟，經超低溫保存后，恢復生長獲得再生植只有少數，如柿子，其余的研究屬于階段性研究或生理性的研究。在枇杷超低溫保存方面只有一項利用程序降溫儀進行花粉處理的試驗（劉月學，2004）。

將程序降溫應用于薔薇科果樹乃至植物的超低溫保存，成功的例子較少，僅有少數幾個報道。例如馬鋒旺等在《杏愈傷組織的超低溫保存》（[J].西北植物學報,1999,19（1):67-70）中研究了薔薇科果樹的杏子種質資源的超低溫保存，將杏愈傷組織加入預冷的冰凍保護劑，平衡后用Paris750008型程序冷凍機冷卻至-40℃，停留2h后投入液氮罐保存48h，化凍后用TTC法檢測相對存活率，接于繼代培養基上培養，恢復生長。但技術方案愈傷組織存活率不高，最高相對成活率為57.9%，總的生長量比對照小，多次轉移培養，均未分化出不定芽。

并指出不同品種基因型間超低溫保存的效果不同。